(二)核酸电泳技术
即将提取的病原体核酸进行电泳的方法,也可用于病原学诊断。这种方法一般适用于病原分离和鉴定之后,可区别同一血清型不同亚型。如具有分段RNA基凼组的轮状病毒,叫用此方法区别亚型。另外,双链DAN病毒如疱疹病毒,将其提纯物用限制性内切酶处理后进行电泳,根据其片段不同可区别血清型。在病原细菌,提取质粒后进行电泳,根据其大小和数量进行分析和比较,可区别未知血清型和耐药性,也可用于多发疾病的感染途径等流行炳字分析。
(三)PCR技术
PCR技术又称基因体外扩增技术。根据已知病原微生物特异性核酸序列(目前可以在因特网GeneBank中检索到很大一部分病原微生物特异性核酸序列),设计合成与其5,端同源、3,端互补的2条引物,在反应管中加入待检的病原微生物核酸(称为模板DNA)、引物dNTP和具有热稳足性的碱基DNA聚合酶。在适当条件(Mg2+,pH等)下,置于自动化热循环仪(PCR仪)中,经过变性、复性、延1甲二柙反应温度,此为一个循环,每次扩增可进行20-30个循环。如果待检的病原微生物核酸与引物上的碱基匹配,合成的核酸产物就会以2n(/,为循环次数)指数形式递增。产物经琼脂糖凝胶电泳,可见到预期大小的DNA条带,根据电泳结果可作出确切诊断。PCR技术具有高度敏感性和特异性,方法检测。另外,PCR技术为检测那些生长条件苛刻、培养困难的病原体,为潜伏感染或病原核酸整合到感染动物体细胞基因组的病原体检疫,提供了极为有效的手段。PCR技术与其他分子生物学诊断技术组合,形成了限制性片段长度多态性( PCR-RFLP)、反转录PCR ( RT-PCR),单链构象多态性( PCR-SSCP )、随机扩增多态性DNA ( RAPD)等技术。
1。限制性片段长度多态性 将PCR方法扩增的DNA片段,用限制性内切酶进行酶切后,经电泳比较酶切片段的方法。电泳后还可以利用DNA杂交技术进一步分析。
2.反转录PCR 利用反转录酶将RNA翻转录成cDNA后,用常规的PCR方法扩增特异性片段。这种方法可扩增出mRNA或RNA病毒基因组中特异性片段。
。 3.单链构象多态性 将双链DNA片段变性后成为单链时,单链DNA靠自身碱基序列形成立体结构。这种DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中边加热边电泳时,根据其立体结构的差异,即使是长度相同但立体结构不同的DNA片段,其电泳位置也不同。
该方法可检出数百个碱基序列的DNA片段中只有一个碱基差异的不同DNA片段,故非常敏感。