段宏安，张  睿，李金华，汪连军，刘小琴

（连云港出入境检验检疫局，江苏  连云港222042）

中图分类号：S851．4    文献标识码：B  文章编号：0529－6005（2002）12－0042－04

    牛海绵状脑病（BSE，又称疯牛病）是牛的一种致死性神经系统疾病，即众所周晓 的传染性海绵状脑病（TSE），最近科学家估量 进食含BSE的牛肉与人群发生变异型克雅氏病（vCJD）有关［1～2］。这些疾病的特点 是埋伏期长，可从数月至数年，埋伏期内无可见症状，牛BSE平均埋伏期为4～6年，在人是至少9年[2]，患者涌现短暂神经症状后死亡，目前尚无有效治疗方法。目前在英、法、德、瑞士、丹麦、阿曼、葡萄牙、爱尔兰、比利时、卢森堡、西班牙、意大利等国均有报道。至2000年1月份，英国共有384万多头牛被销毁。自从英国于1996年发生第1例vCJD病以来，来 2000年1月，单英国就有52人患此病死亡。因此BSE对人畜健康和食品安全卫生的影响后果非常庞大，引起世人广泛关注。对于该病病原，普遍认为是由一种蛋白质性的感染颗粒也称为朊蛋白引起的，是一种病理细胞朊蛋白（PrPSc），由常态细胞朊蛋白（PrPc，约250个氨基酸的蛋白质）转变而来，不含DNA或RNA。病原对外界理化原因抗击力极强，高压蒸汽灭菌134～138℃ 18 min不能使病牛脑组织完全灭活，对次氯酸钠溶液，NaOH溶液有很强抗击力，常规组织固定方法不能灭活。BSE流行病学和传播途径研究掩饰，BSE的发生可追溯来 被TSE如痒病病原污染的加工饲料成分、白粉及肉骨粉（MBM）等[1～2]， MBM是哺乳动物组织加工产品，是最普遍应用的动物饲料的蛋白质来源，MBM被认为是主要的传播途径，而今MBM在许多国家被禁用于反刍动物饲料，对动物饲料的控制、禁止使用反刍动物蛋白甚至所有哺乳动物组织成分词喂反刍动物，禁止牛源性风险成分进入动物及人食物链是防止BSE侵入和传播，保证人身安全免受VCJD侵害的关键措施。中国、欧盟各国、美国、日本等国都颁布了有关公告和禁令。能否很好地执行这些规定在很大程度上取决于检测食品及反刍动物饲料中的禁止成分。食品和饲料中动物性成分及种类鉴别估量 方法主要取决于对DNA、蛋白及骨片段的估量 。但是食品和饲料制备过程中的热处理可破坏及降解DNA及蛋白质，因此对这些估量 方法有一定影响。

1  DNA估量 方法

    DNA估量 方法是分离鉴定生物性材料的一种常用方法，DNA存在于细胞核中（基因组DNA）、线粒体（线粒体DNA）以及植物细胞叶绿体等细胞器中。热处理对DNA的结构有两种影响，其一是使DNA变性，养猪论坛 ，双股DNA分子变成单股，某一DNA分子变性的温度各不相同，取决于GC含量、盐分、长度及DNA拓朴结构等。线性DNA通常在60～100℃变性；其二是改变DNA的初级结构，高温高压下DNA分子变成短片段。DNA估量 方法的目标序列通常是种间高度保守的序列，核糖体DNA是常用的种类鉴别序列，卫星DNA及随机重复序列也被应用来 ，其他数种染色体及线粒体DNA也被用于肉类鉴别，DNA估量 方法常选用杂交及筛选性扩增方法。

1．1  DNA杂交DNA杂交方法分指纹技术及完整DNA方法。前一种常用Southern印迹，在杂交前DNA被酶切成小片段，并按大小分开；另一种方法，如斑点杂交方法适用完整DNA分子。DNA指纹技术不适用于化制产品，因为DNA降解过程会产生不同大小的DNA片段，将会影响结果判定。斑点杂交技术适用于热处理产品，该方法被应用于80℃、100℃及120℃加热处理的鸡、猪、山羊、绵羊及牛肉的DNA估量 ，探针是使用每种动物的基因组DNA。该方法检测限可达0．l mg。但是山羊、绵羊与牛存在很大交叉反应，因为他们的基因组很相似。交叉反应可用未标记的绵羊DNA进行阻断。为了鉴别热处理肉类，以卫星DNA为靶序列设计的22个碱基的探针用于鉴别牛、山羊、绵羊、马、鹿、猪、鸡和火鸡肉，经过120℃ 90 min高压处理，虽然强度减弱但杂交信号仍很含糊，检测限可达l％～5％，另外用PCR产生的可与种类特异性卫星DNA结合的探针杂交技术更耐用，可检测鲜肉0．l％～0.5％，高压处理肉样品0. 5 ％～5 ％ [2]。

1．2 PCR扩增 PCR技术是应用耐热DNA聚合酶特异性地扩增目的DNA片段，扩增的片段可以用以下方法进行估量 和鉴别：凝胶电泳、DNA测序、单链同一性估量 （SSCA）、质谱估量 等。PCR方法使用几种不同的目的序列，线粒体DNA是一种很好的序列，因为每个细胞中含有大量线粒体基因组（约2 300个拷贝），方法的灵敏度大大提高，Tartaglia等［3～4]介绍一种检测反刍动物饲料中牛线粒体的PCR方案，该方法以牛线粒体DNA的tRNA的3´端、ATPase 8和ATPase 6的氨基端为目的片段，此片段在植物中未发觉，并且在脊椎动物中表现为高度变异性。该方法可以检测牛源性MBM 0．125％样品中的牛线粒体DNA，该方法经FDA多方评估，但没有确定灵敏度，也非定量。而且该方法是牛特异性的，不能检测其他反刍动物成分。另一种方法应用于盐腌、加热或发酵肉品的种类鉴别[5～6]，所用引物是脊椎动物线粒体Cytb基因的保守区互补系列。对目的DNA片段的限制性内切酶估量 可检出多种野生动物及猪、牛、山羊、马、鸡、火鸡的限制性片段多态性，PCR－RFLP估量 方法从含牛肉的热处理肉类混合物中检出低于l％的牛肉。22种未晓 cytb基因序列的动物包括偶蹄动物和禽类的种内和种间差异可用20种不同限制性内切酶进行估量 。有人研究了热处理肉中猪肉的PCR检测方法［7～8]，该方法扩增18S核糖体及线粒体基因高度保守区序列，可从鲜肉及热处理牛肉和猪肉混合物中检出低于2％的猪肉。