非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引发的、在猪群中具有极强传染性和高致病性的疾病。ASFV毒力极强，无论是家猪还是野猪感染后，其致死率可接近或达到100%。目前，全球范围内尚未研发出安全有效的商业化疫苗或特效治疗药物。一旦猪场发生疫情，极易导致恐慌性清场和大规模扑杀行动，这不仅给养殖者造成重大经济损失，还会严重威胁民生“菜篮子”工程，造成猪肉供应短缺和市场价格剧烈震荡。因此，养殖场防控非洲猪瘟的核心策略在于主动实施病原监测，及时识别病毒威胁，从而实现早期预警、精准防控和风险可控的目标。
1、非洲猪瘟病毒特征，传播途径和症状
1.1非洲猪瘟病毒特征
非洲猪瘟病毒（ASFV）属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是该病毒属的代表性病原体。其基因组为线性双链DNA结构，长度约为170～190 kb。成熟的病毒颗粒直径范围在175～215 nm之间，表面包裹有囊膜结构。ASFV主要在猪体内的细胞质中进行复制，尤其偏好定位于网状内皮细胞和单核巨噬细胞。该病毒的潜伏期受毒株特性、宿主状态以及感染途径等多种因素影响，通常为5～19 d，但有时可延长至21 d。
1.2非洲猪瘟病毒的传播途径
非洲猪瘟病毒（ASFV）的传播存在多种途径。一方面，可通过钝缘蜱等媒介昆虫的刺吸活动传播；另一方面，易感猪只接触感染猪或其分泌物/排泄物、以及被病毒污染的环境或物品（如饲料、饮水、栏舍、垫料、器具、车辆等）均可导致感染。
1.3 ASF的症状
ASF临床表现可分为最急性、急性、亚急性和慢性。猪只死亡率因感染的毒株不同而有所差异，感染高致病性毒株死亡率可达90%～100%，最急性常无明显临床症状突然死亡。中等致病性毒株在感染猪只的月龄不同而导致死亡率有所差异，成年猪的死亡率在20%～40%，幼年猪死亡率在70%～80%之间。低致病性毒株死亡率虽在10%～30%间，但会使被感染猪只渐进性消瘦，虚弱，发育迟缓，关节肿胀和皮肤溃疡等症状。急性非洲猪瘟主要症状有：体温升高；耳、四肢、腹部皮肤有点状出血；眼鼻有黏液浓性分泌物，咳嗽；沉郁厌食；可视黏膜潮红，发绀；共济失调、步态僵直瘫痪，抽搐等其他神经症状；呕吐，便秘，粪便表面有血液和黏液覆盖；妊娠母猪流产。幸存猪可终身带毒。
2、实时荧光聚合酶链反应（实时荧光PCR）
实时荧光聚合酶链反应（real-time PCR，也称为定量PCR或qPCR）Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction/Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称qPCR，是一种在PCR体系中加入荧光标记物，通过持续追踪荧光信号的累积来实时监控整个扩增过程的分子检测技术。该技术通过绘制实时扩增曲线，能够实现对样本中初始模板DNA的定量分析。real-time PCR灵敏度极高，能够快速、准确地从多种样本（如猪的鼻咽拭子、血液、组织器官及环境样品）中检出非洲猪瘟病毒（ASFV）的核酸。基于这些检测结果，养殖场可及时采取精准的疫病防控与消毒措施。
2.1实时荧光PCR需要的设备、试剂和耗材
养殖场需内设兽医实验室，并配备有生物安全柜、0.5～10 uL单道移液器、10～100 uL单道移液器、20～200 uL单道移液器、病毒核酸柱式提取试剂盒或核酸提取仪（磁珠法）和配套的核酸提取试剂盒、实时荧光定量PCR仪、研磨仪、商品化的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、八连管、1.5 mL离心管、一次性乳胶手套、口罩等兽医实验室耗材。
2.2样品采集、保存和运输
活猪样品可采集鼻咽拭子（倒入10%甘油PBS溶液保存）、无菌采集抗凝血（首选EDTA或枸橼酸盐抗凝管，不可使用肝素钠）或按常规方法分离血清5 mL。病死猪或屠宰猪样品可无菌采集脾脏、淋巴结、肾脏、肌肉等组织样品5 g。环境样品包括粪便、相关区域饲料及污水等，采集后需在2～8℃的低温环境中保存并运输至实验室，以供后续检测。
2.3样品处理
鼻咽拭子、环境拭子、抗凝血和血清可编号后直接取用。组织样品用无菌的镊子和剪刀剪取适当大小的组织块放入盛有PBS缓冲液和磁珠的研磨管中，用组织匀浆仪匀浆处理。经充分震荡研磨后，以10 000 r/min离心3 min后取上清液，置于1.5 mL离心管中编号备用。
2.4 DNA提取
根据说明书使用商品化核酸提取试剂盒对处理好的样品进行核酸提取，提取好的DNA应尽快进行PCR扩增（尽量不要超过2 h），若需长期保存须放置在-70～-40℃以下冰箱。
2.5反应体系的配置
使用市面上所售的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，先拿出各试剂平衡至室温（15～25℃），融化后瞬时离心备用。每次检验需设立阴、阳性对照。设待检样品、阳性对照和阴性对照的样品总份数为n（n=待检样品数+1阴性对照+1阳性对照），将配置好的反应体系轻弹混匀，瞬时离心，分装至八连管中。然后将已提取DNA的待检样品、阴性对照和阳性对照分别加入相应的八连管中，扣紧管盖后瞬时离心，排除反应液中气泡（具体操作按各品牌商品化试剂盒说明书配置反应体系和加样）。
2.6上机扩增
将八连管做好标记放入实时荧光PCR仪内，记录好样本摆放顺序。选择FAM通道，并按试剂说明书设置反应参数。一般反应参数设置为：第一阶段，预变性95℃3 min；第二阶段，95℃10 s，60℃30 s共45个循环、荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行（具体操作按各品牌商品化试剂盒说明书配置反应参数设置）。
2.7结果判定
第一步，判断试验结果是否成立。
阳性对照需满足CT值≤35且呈现特异性扩增曲线，同时阴性对照应无CT值且无非特异性扩增曲线。满足上述条件，则试验结果成立。
第二步，进行样品结果判定。
阳性判定：被检样品CT值≤35且呈现特异性扩增曲线者，判定非洲猪瘟病毒核酸阳性。
阴性判定：被检样品无CT值或CT值≥40且无非特异性扩增曲线者，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。
疑似判定：30＜CT值＜40且呈现特异性扩增曲线者，判定为非洲猪瘟病毒核酸疑似。
复检规则：对疑似样品应重新取样复检。复检时，若CT值＜40且呈现特异性扩增曲线，则判为阳性；否则判定为阴性。（具体CT值标准区间按各品牌商品化试剂盒说明书判定）。
3、对检测结果的判定和处理
对环境样品检测到非洲猪瘟病毒核酸的，应对栏舍、空气、办公区、衣物间等环境做好全面消杀工作，可使用过硫酸氢钾类消毒剂。消杀后应定期采集环境样品，检测非洲猪瘟病毒核酸存在情况。
在养殖场的自主监测中，若生猪样品检测呈非洲猪瘟病毒核酸阳性，但存栏生猪群体未观察到疑似临床症状，则此阳性结果属于自主监测阳性。应立即上报养殖场所在地县级以上动物疫病预防控制机构进行复检，并做好隔离观察和全面消杀工作。
对生猪样品检测到ASF病毒核酸的，并且符合下列临床症状、剖检病变标准、流行病学任何一项的，可能为可疑病例。应报养殖场所在地县级以上动物疫病预防控制机构，开展复检确认。经省级动物疫病预防控制机构实验室进行判定确诊。
临床症状：1）超出正常范围的发病率或死亡率，或者无征状突然死亡；2）皮肤溃疡或关节肿胀；3）母猪发生流产、死胎的；4）皮肤呈现红紫色，发绀；5）出现高热或结膜炎；6）出现腹泻或呕吐；7）出现神经症状。符合第1条且出现其他任一条件的，判定为符合临床症状标准。
病理剖检特征：1）下颌淋巴结肿胀或出血；2）关节炎；3）脾脏明显肿大；4）心包积液或绒毛心；5）腹腔淋巴结肿胀或出血；6）脾脏出现出血性梗死。满足上述任一特征的，判定为符合病理剖检标准。
流行病学条件：1）使用泔水作为饲料，导致猪群出现异常发病或死亡；2）猪群已完成猪瘟、猪呼吸与繁殖综合征等疫苗免疫程序，但发病率和死亡率仍超出正常范围；3）放养猪只接触垃圾或野猪，导致发病异常，死亡的；4）发生外部人员或车辆进出养殖场、更换饲料、购入新猪、养殖场内人员购买生猪产品等高风险行为后，猪群出现发病异常，死亡的。出现上述任一条件的猪群，符合流行病学标准。
确诊后应按照“早、快、严、小”核心原则做好防控措施，包括：对阳性猪及其同群猪进行扑杀；对养殖场进行全面清洗和消毒（10%苯及苯酚、碱类等可有效杀灭ASFV核酸。车辆、建筑物和相关设施设备可使用氯化物和酚类化合物进行消毒）；对其他猪群进行为期21 d的隔离观察；在隔离期间，若未出现异常发病或死亡现象，且未检测到ASF病毒核酸，可继续饲养或就近屠宰。
1、非洲猪瘟病毒特征，传播途径和症状
1.1非洲猪瘟病毒特征
非洲猪瘟病毒（ASFV）属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是该病毒属的代表性病原体。其基因组为线性双链DNA结构，长度约为170～190 kb。成熟的病毒颗粒直径范围在175～215 nm之间，表面包裹有囊膜结构。ASFV主要在猪体内的细胞质中进行复制，尤其偏好定位于网状内皮细胞和单核巨噬细胞。该病毒的潜伏期受毒株特性、宿主状态以及感染途径等多种因素影响，通常为5～19 d，但有时可延长至21 d。
1.2非洲猪瘟病毒的传播途径
非洲猪瘟病毒（ASFV）的传播存在多种途径。一方面，可通过钝缘蜱等媒介昆虫的刺吸活动传播；另一方面，易感猪只接触感染猪或其分泌物/排泄物、以及被病毒污染的环境或物品（如饲料、饮水、栏舍、垫料、器具、车辆等）均可导致感染。
1.3 ASF的症状
ASF临床表现可分为最急性、急性、亚急性和慢性。猪只死亡率因感染的毒株不同而有所差异，感染高致病性毒株死亡率可达90%～100%，最急性常无明显临床症状突然死亡。中等致病性毒株在感染猪只的月龄不同而导致死亡率有所差异，成年猪的死亡率在20%～40%，幼年猪死亡率在70%～80%之间。低致病性毒株死亡率虽在10%～30%间，但会使被感染猪只渐进性消瘦，虚弱，发育迟缓，关节肿胀和皮肤溃疡等症状。急性非洲猪瘟主要症状有：体温升高；耳、四肢、腹部皮肤有点状出血；眼鼻有黏液浓性分泌物，咳嗽；沉郁厌食；可视黏膜潮红，发绀；共济失调、步态僵直瘫痪，抽搐等其他神经症状；呕吐，便秘，粪便表面有血液和黏液覆盖；妊娠母猪流产。幸存猪可终身带毒。
2、实时荧光聚合酶链反应（实时荧光PCR）
实时荧光聚合酶链反应（real-time PCR，也称为定量PCR或qPCR）Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction/Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称qPCR，是一种在PCR体系中加入荧光标记物，通过持续追踪荧光信号的累积来实时监控整个扩增过程的分子检测技术。该技术通过绘制实时扩增曲线，能够实现对样本中初始模板DNA的定量分析。real-time PCR灵敏度极高，能够快速、准确地从多种样本（如猪的鼻咽拭子、血液、组织器官及环境样品）中检出非洲猪瘟病毒（ASFV）的核酸。基于这些检测结果，养殖场可及时采取精准的疫病防控与消毒措施。
2.1实时荧光PCR需要的设备、试剂和耗材
养殖场需内设兽医实验室，并配备有生物安全柜、0.5～10 uL单道移液器、10～100 uL单道移液器、20～200 uL单道移液器、病毒核酸柱式提取试剂盒或核酸提取仪（磁珠法）和配套的核酸提取试剂盒、实时荧光定量PCR仪、研磨仪、商品化的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒、八连管、1.5 mL离心管、一次性乳胶手套、口罩等兽医实验室耗材。
2.2样品采集、保存和运输
活猪样品可采集鼻咽拭子（倒入10%甘油PBS溶液保存）、无菌采集抗凝血（首选EDTA或枸橼酸盐抗凝管，不可使用肝素钠）或按常规方法分离血清5 mL。病死猪或屠宰猪样品可无菌采集脾脏、淋巴结、肾脏、肌肉等组织样品5 g。环境样品包括粪便、相关区域饲料及污水等，采集后需在2～8℃的低温环境中保存并运输至实验室，以供后续检测。
2.3样品处理
鼻咽拭子、环境拭子、抗凝血和血清可编号后直接取用。组织样品用无菌的镊子和剪刀剪取适当大小的组织块放入盛有PBS缓冲液和磁珠的研磨管中，用组织匀浆仪匀浆处理。经充分震荡研磨后，以10 000 r/min离心3 min后取上清液，置于1.5 mL离心管中编号备用。
2.4 DNA提取
根据说明书使用商品化核酸提取试剂盒对处理好的样品进行核酸提取，提取好的DNA应尽快进行PCR扩增（尽量不要超过2 h），若需长期保存须放置在-70～-40℃以下冰箱。
2.5反应体系的配置
使用市面上所售的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，先拿出各试剂平衡至室温（15～25℃），融化后瞬时离心备用。每次检验需设立阴、阳性对照。设待检样品、阳性对照和阴性对照的样品总份数为n（n=待检样品数+1阴性对照+1阳性对照），将配置好的反应体系轻弹混匀，瞬时离心，分装至八连管中。然后将已提取DNA的待检样品、阴性对照和阳性对照分别加入相应的八连管中，扣紧管盖后瞬时离心，排除反应液中气泡（具体操作按各品牌商品化试剂盒说明书配置反应体系和加样）。
2.6上机扩增
将八连管做好标记放入实时荧光PCR仪内，记录好样本摆放顺序。选择FAM通道，并按试剂说明书设置反应参数。一般反应参数设置为：第一阶段，预变性95℃3 min；第二阶段，95℃10 s，60℃30 s共45个循环、荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行（具体操作按各品牌商品化试剂盒说明书配置反应参数设置）。
2.7结果判定
第一步，判断试验结果是否成立。
阳性对照需满足CT值≤35且呈现特异性扩增曲线，同时阴性对照应无CT值且无非特异性扩增曲线。满足上述条件，则试验结果成立。
第二步，进行样品结果判定。
阳性判定：被检样品CT值≤35且呈现特异性扩增曲线者，判定非洲猪瘟病毒核酸阳性。
阴性判定：被检样品无CT值或CT值≥40且无非特异性扩增曲线者，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。
疑似判定：30＜CT值＜40且呈现特异性扩增曲线者，判定为非洲猪瘟病毒核酸疑似。
复检规则：对疑似样品应重新取样复检。复检时，若CT值＜40且呈现特异性扩增曲线，则判为阳性；否则判定为阴性。（具体CT值标准区间按各品牌商品化试剂盒说明书判定）。
3、对检测结果的判定和处理
对环境样品检测到非洲猪瘟病毒核酸的，应对栏舍、空气、办公区、衣物间等环境做好全面消杀工作，可使用过硫酸氢钾类消毒剂。消杀后应定期采集环境样品，检测非洲猪瘟病毒核酸存在情况。
在养殖场的自主监测中，若生猪样品检测呈非洲猪瘟病毒核酸阳性，但存栏生猪群体未观察到疑似临床症状，则此阳性结果属于自主监测阳性。应立即上报养殖场所在地县级以上动物疫病预防控制机构进行复检，并做好隔离观察和全面消杀工作。
对生猪样品检测到ASF病毒核酸的，并且符合下列临床症状、剖检病变标准、流行病学任何一项的，可能为可疑病例。应报养殖场所在地县级以上动物疫病预防控制机构，开展复检确认。经省级动物疫病预防控制机构实验室进行判定确诊。
临床症状：1）超出正常范围的发病率或死亡率，或者无征状突然死亡；2）皮肤溃疡或关节肿胀；3）母猪发生流产、死胎的；4）皮肤呈现红紫色，发绀；5）出现高热或结膜炎；6）出现腹泻或呕吐；7）出现神经症状。符合第1条且出现其他任一条件的，判定为符合临床症状标准。
病理剖检特征：1）下颌淋巴结肿胀或出血；2）关节炎；3）脾脏明显肿大；4）心包积液或绒毛心；5）腹腔淋巴结肿胀或出血；6）脾脏出现出血性梗死。满足上述任一特征的，判定为符合病理剖检标准。
流行病学条件：1）使用泔水作为饲料，导致猪群出现异常发病或死亡；2）猪群已完成猪瘟、猪呼吸与繁殖综合征等疫苗免疫程序，但发病率和死亡率仍超出正常范围；3）放养猪只接触垃圾或野猪，导致发病异常，死亡的；4）发生外部人员或车辆进出养殖场、更换饲料、购入新猪、养殖场内人员购买生猪产品等高风险行为后，猪群出现发病异常，死亡的。出现上述任一条件的猪群，符合流行病学标准。
确诊后应按照“早、快、严、小”核心原则做好防控措施，包括：对阳性猪及其同群猪进行扑杀；对养殖场进行全面清洗和消毒（10%苯及苯酚、碱类等可有效杀灭ASFV核酸。车辆、建筑物和相关设施设备可使用氯化物和酚类化合物进行消毒）；对其他猪群进行为期21 d的隔离观察；在隔离期间，若未出现异常发病或死亡现象，且未检测到ASF病毒核酸，可继续饲养或就近屠宰。
