我国是全球最大的生猪生产国，随着养猪业规模化、集约化发展进程持续推进，猪呼吸道疾病成为对生猪养殖危害较大的疾病之一。该病病因复杂，可由多种病原微生物协同或单独诱发，因此建立快速、灵敏且能同时鉴别多种病原的一体化检测技术，对疫病精准防控具有重要现实意义。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）均可引起猪呼吸道疾病，且都为RNA病毒，在不同规模养殖场中普遍存在多种病毒混合感染的情况。由于PRRSV、CSFV和SIV感染猪的临床症状高度相似，使得养殖人员难以通过病猪的临床表征进行精准鉴别。针对上述问题，本研究拟通过多组引物和特异性TaqMan探针的设计和筛选，构建一种能同时检测3种病原的多重荧光定量PCR方法，为猪呼吸道相关疾病的快速确诊、流行病学监测及精准防控提供技术支撑。
1、方法
从GenBank数据库中分别收集近年流行的三种病毒基因序列，10株PRRSV，10株CSFV，13株SIV进行比对，分别在PRRSV-M、CSFV-5′UTR及SIV-M基因片段保守区，设计多重荧光定量PCR所需的三组引物及不同荧光基团标记的TaqMan特异性探针。见表1。
为后续建立并优化反应条件，构建阳性模板质粒：将不同病毒基因片段用限制性酶切位点串联至同一个质粒载体；采用其他ASFV、PCV2、PPV、PRV核酸为模板，验证多重荧光定量PCR的特异性；取用不同拷贝数的标准质粒作为模板，建立标准曲线，评价多重荧光定量PCR的灵敏度和可重复性。
通过使用本研究建立的方法检测14份细胞分离的阳性病原样品，9份PRRSV，5份CSFV，评价多重荧光定量PCR的实用性。
2、结果
见图1，本研究建立的多重荧光定量PCR针对不同病毒（PRRSV、CSFV、SIV）所建立的标准曲线具有良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.997；PRRSV、CSFV、SIV最低检测限均为10 copies/μL。该方法与其他病毒无交叉反应，特异性良好。
1、方法
从GenBank数据库中分别收集近年流行的三种病毒基因序列，10株PRRSV，10株CSFV，13株SIV进行比对，分别在PRRSV-M、CSFV-5′UTR及SIV-M基因片段保守区，设计多重荧光定量PCR所需的三组引物及不同荧光基团标记的TaqMan特异性探针。见表1。
为后续建立并优化反应条件，构建阳性模板质粒：将不同病毒基因片段用限制性酶切位点串联至同一个质粒载体；采用其他ASFV、PCV2、PPV、PRV核酸为模板，验证多重荧光定量PCR的特异性；取用不同拷贝数的标准质粒作为模板，建立标准曲线，评价多重荧光定量PCR的灵敏度和可重复性。
通过使用本研究建立的方法检测14份细胞分离的阳性病原样品，9份PRRSV，5份CSFV，评价多重荧光定量PCR的实用性。
2、结果
见图1，本研究建立的多重荧光定量PCR针对不同病毒（PRRSV、CSFV、SIV）所建立的标准曲线具有良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.997；PRRSV、CSFV、SIV最低检测限均为10 copies/μL。该方法与其他病毒无交叉反应，特异性良好。
图1三重荧光定量RT-PCR的标准曲线及敏感性测试扩增曲线
此外，采用不同拷贝数的阳性标准质粒进行多次重复，分析检测结果，整体变异系数值较低（＜1%），表明该方法的重复性和准确性较高。
检测14份细胞分离的阳性目标病原样品的结果显示，本研究建立的方法能有效鉴别检测出目标病原，表明该方法在临床上的实用性较好。
3、结论
本研究建立的多重荧光定量PCR方法特异性强，灵敏度高，可重复性和稳定性好，可一次反应同时检测PRRSV、CSFV、SIV，并进行鉴别诊断上述三种病原，为我国生猪养殖业中猪呼吸道相关疾病的病原检测奠定了基础。
