2018年我国发生非洲猪瘟（以下简称“非瘟”）疫情以来，养猪从业者经历了恐惧、慌乱、无奈、持续战斗并不断取得进展的过程。目前，已总结出各种有效措施来预防及清除非洲猪瘟强毒感染，但非洲猪瘟病毒变异毒株的存在，仍是养猪行业的一个巨大威胁。笔者自2019年以来，深入“防非”一线，持续跟踪调查了一些规模化猪场生物安全体系建设及“防非”措施，本文从生物安全以及非瘟检测两方面总结了一些猪场的做法与经验，供同行讨论借鉴。
1通过系统的生物安全措施阻断非洲猪瘟病毒的场内外传播
生物安全是为降低病原入侵和传播风险而实施的一系列措施集成。“外防输入、内防扩散”包括两层含义。首先是通过外部生物安全措施阻止病毒进场。而病毒一旦突破外防线，进入场内，则需要通过场内生物安全措施把病毒控制在一定范围内不扩散，再通过临床观察与实验室检测进行早期识别，然后快速清除第一发现点的猪群以及通过检测、排查、清除其他可能发生感染的猪群，从而达到净化非洲猪瘟的目的。
1.1场外生物安全要点
场外生物安全的目标是“把非洲猪瘟病毒阻挡在围墙之外”，也就是确保进入或靠近猪场的人、车、物、猪等是安全的。
1.1.1人员：人员进场前一段时间内通常会被要求不能接触各种“风险因素”，然后通过洗澡、更换衣服、隔离等流程才能进场。
1.1.2物资：进场物资需经过多级消毒、静置处理（熏蒸、烘干或浸泡等），紧急物资可以通过专门消毒管控通道进场。
1.1.3车辆：车辆一般需要经过一级洗消点初洗、二级洗消点精洗、消毒、烘干和门卫清洗消毒后才能进场或接近猪场。
1.1.4猪：引进猪和精液是猪场引进病原的最大风险之一，需经过隔离和严格检测，确保安全后才能进场，入场之后需要有专门的隔离单元，方便对猪只进行检测、隔离和驯化。
1.2场内生物安全要点
场内生物安全的目标是“把非洲猪瘟病毒控制在第一感染点”，也就是通过隔离、阻断、清洁和消毒确保进场的病毒在被发现前不出现大范围扩散。
1.2.1分区管理：猪场根据工作区分布情况实施分区管理，一般划分为门卫区、人员隔离区、生活区、生产区和环保区等。生产区再以生产单元为单位划分为若干个区域，比如配怀区、产房区、公猪舍、后备区、保育区和育肥区等。各个区域以实体墙隔断并独立运行。工具、物资和人员等避免交叉，如确需交叉，需要做好清洗消毒工作。
1.2.2生产区最适单元格划分：生产区以最适单元格等进行划分，单元格之间避免交叉，如确需交叉，需要做好清洗消毒工作。
1.2.3净污道路分开：场区内严格划分净道和污道，车辆按照规定路线行驶。净道污道如有交叉，不同的作业则分时段操作，并在操作前后对道路消毒。
1.2.4人员流动：后勤人员跨区流动要进行安全处理，比如进舍要洗澡、换工作服和靴（鞋）子，车辆跨区时要对轮胎消毒。员工出入猪舍应按规定淋浴、换工作服和靴子，舍内、舍外、生活区的衣靴不得交叉。
1.2.5饮水分开：为避免饮水传播病毒，尽量使用深层地下水或者自来水，并避免通槽饮水。
1.2.6定时巡栏：一线人员每天对猪群巡栏至少两次，对所有出现异常表现的猪采样、检测，做到早检测、早发现。一旦非洲猪瘟病毒核酸检测呈阳性，结合临床表现，确认为非洲猪瘟病毒感染，立即启动应急预案。
1.3执行关键点
1.3.1配套的硬件设施是生物安全措施彻底执行的基础。配备必要的工具和设施，减轻工作量，减少操作步骤，才能让执行人员长期稳定地把生物安全做好。另一方面，对硬件设施进行优化设置，减少人员犯错的可能，也很重要。比如建设实体隔断（墙、围挡）阻止人员跨区就比划线警示要靠谱得多。
1.3.2现场带教、培训和定期检查是生物安全措施彻底执行的保障。生物安全是一个系统工程，要求人人遵循，不能有明显的漏洞。而让人人都理解并执行到位，并不是一件容易的事情。通过持续不断地培训提高执行人员的认知，通过定期检查查缺补漏，并建立监督和考核制度，才可能让整体生物安全方案被正确执行。
1.3.3不断地优化和改进是生物安全的灵魂。没有完美的生物安全，只有不断优化和改进的生物安全。定期对每个猪场的生物安全方案和执行情况进行评估，结合现场实际情况进行优化和改进，抓关键点并化繁为简，使生物安全方案更加科学、合理和容易执行。
2增强种群健康、提高病毒感染“阈值”
非洲猪瘟病毒具有典型的“欺软怕硬”的特征。健康度差、处于亚健康状态或应激状态的猪群经常成为受害者。事实证明，提高猪群的整体健康度，大大有利于非洲猪瘟的防控。
2.1增强营养：在非瘟流行以及饲料全面禁抗的背景下，调整饲料配方，增强营养，保证猪群各个阶段营养充分，提高猪群整体抵抗力。
2.2环控保障：千方百计为猪群提供舒适的环境，保证温度适宜、空气新鲜洁净等。
2.3疫病防控：猪场重大疫病的有效防控，尤其是免疫抑制病的控制，是保障猪群健康的基础。净化猪瘟、猪蓝耳病和伪狂犬病等重要疫病，有利于非洲猪瘟的预防和控制。
2.4淘汰弱差：及时淘汰猪群中的弱差猪和亚健康猪，避免这些猪成为病毒感染、增殖和传播的突破口。
3准确及时的检测是预防和清除非洲猪瘟病毒的关键因素
及时准确地给出检测结果，为非瘟防控方案的制定提供强有力的支持，是猪场实验室的核心任务。为了使检测结果准确及时，不同场景下应使用不同的检测方法，并制定差异化的监测预警方案。
3.1荧光定量PCR
首先，通过比对试验和临床使用数据分析，筛选到稳定且灵敏度高的检测试剂盒。荧光定量PCR适合在基础条件较好的实验室进行，适合对时间要求不高，但对敏感性、特异性和批量要求高的样品。适合场景：（1）对临床样品进行批量检测；（2）对临床上其他方法快速检测的样品进行复核检测；（3）对临床疑似样品进行复核检测；（4）对来源于环境等可能是弱阳性的样品进行检测。
3.2核酸快检方法
目前，市场上有不少传统的快速检测试剂，适合在现场进行快速检测，特点是其对实验条件要求不高，操作简便，快速出结果。类似产品在灵敏性、特异性和稳定性上与荧光定量PCR仍有差距，疑似样品通常要送到实验室用荧光定量PCR方法复核。用多酶恒温快速扩增技术（MIRA）研发的新型非瘟核酸快速检测试剂盒，20分钟左右核酸扩增出结果，灵敏性虽稍差于荧光定量PCR，但特异性很高，仪器设备简单，操作方便，适合现场急需结果的场景，比如急于运行的车辆、急于进场的人员以及感染场疑似猪群的快速现场筛查等。其缺点是成本高。笔者用荧光定量PCR与MIRA快检方法分别检测了包括全血和血清等在内的各种类型的样品，对于荧光定量PCR的CT值在38以下的样品，MIRA能够稳定检测出来，部分数据对比结果见表1。
表1 qPCR与MIRA检测数据对比
3.3抗体检测
对可疑猪群进行跟踪检测时，通常会检测非瘟抗体，结合核酸检测结果，作出临床判断。
部分应用场景：（1）核酸检测存疑暂时无法确诊时，可结合抗体检测作出判断；（2）结合核酸检测确认猪群是否存在变异毒株感染；（3）筛查猪群中是否存在感染康复猪或无症状感染猪。
抗体筛查方案：（1）抗体检测的灵敏性和特异性虽不如荧光定量PCR，但是抗体产生后相对稳定，临床中可以和病原检测结合使用，两种方法相辅相成；（2）筛查猪群中的康复猪或无症状感染猪，要选择高灵敏度的试剂盒，以免漏检。这类试剂盒会有一定比例的假阳性（比如3%～5%），对阳性和可疑结果可选用另一种抗体检测试剂盒做复核检测，然后再持续跟踪检测可疑猪群，直至风险完全解除；笔者在临床实践中使用一种国外品牌非瘟抗体检测试剂盒筛查临床血清，并用国内某品牌试剂盒对筛查的可疑及阳性样品进行复核，并持续跟踪检测被采样的猪及猪群，以确认样品的阴阳性。数据显示，用于抗体筛查的国外品牌试剂盒的假阳性率约为4.8%，如图1所示；（3）对于筛查及复核确认的阳性样品，可检测CD2v抗体，以鉴定感染毒株的CD2v基因是否发生大的变异或缺失；（4）还有一种非瘟抗体检测试剂盒，其检测的抗体不针对p72、p54和p30等常用来研制亚单位疫苗的抗原，因此可以用来区分亚单位疫苗免疫猪和病毒感染猪，作为一种技术储备，值得关注；（5）临床应用案例分析：笔者应用上述方案检测临床样品，观察并证实了多种情况，可见临床样品复杂多样。非瘟抗体总体检测策略及临床检测到的典型样品见表2。
图1某国外品牌非瘟抗体检测试剂盒筛查临床血清样品结果分析
表2非瘟抗体检测方案及结果分析
注：*：区分亚单位疫苗免疫抗体与病毒感染抗体；
#：CD2v发生大的变异或缺失毒株；
&：抗体的结果分析仅供参考，疑似和可疑样品需要持续跟踪检测；
+：阳性，-：阴性，+/-：疑似，N：不做。
4总结非
控制传染源、切断传播途径和保护易感者，是控制传染病流行的关键环节。对疑似感染猪进行隔离、对确诊的感染猪进行无害化处理是控制传染源；分区管理，空气过滤，实体隔断，饮水、环境、物资和工具消毒，防鸟、蚊蝇和老鼠等都是切断传播途径；加强营养、改善环境、提升猪群特异性或非特异性免疫力等是保护易感动物。从广义上来讲，所有这些保护猪群的措施都属于生物安全范畴。因此，对于“防非”，除了生物安全，似乎没有更好的选择。织密生物安全体系之“天网”，可以阻断病毒入侵和扩散；而打造灵敏的检测体系则是安装疫病防控之“鹰眼”，便于及时发现和清除“隐患”及“病灶”。生物安全体系和监测预警体系都是系统工程，在实际操作过程中，要依据猪场的优势、特点和实际情况，选择适合本场的方案。
专家点评
自2018年我国发生非洲猪瘟以来，猪场的生物安全被提到了前所未有的高度，尤其是一些大型养殖集团和规模化猪场，都快速建立猪场内外生物安全体系，这对于控制非瘟病毒的传播起到了重要的作用。李国新研究员自2019年以来深入生产一线参与非洲猪瘟的防控，积累了丰富的现场经验，结合严谨的科研思维，总结出一套可行的生物安全防控措施和贴近生产实际的实验室非洲猪瘟检测方案。首先，作者阐述猪场内外的生物安全设计和管理以阻断非洲猪瘟病毒进入猪场，重点强调一线人员执行力对于生物安全有效性的作用，比如设施如何人性化的设计以便于一线员工执行生物安全，如何通过现场带教、培训和定期检查对生物安全的执行进行纠偏，定期对每个猪场的生物安全方案和执行情况进行评估，结合现场实际情况进行优化和改进，抓关键点并化繁为简，使生物安全方案更加科学、合理和容易执行。其次，作者简要介绍通过饲养管理和疫病防控如何保护易感动物，比如对猪群提供高营养水平的饲料、良好的环境控制管理、其他动物疫病防控及淘汰健康度差的易感猪只等。最后，通过不同诊断方法在非洲猪瘟检测对比及其应用的场景介绍，让养猪生产者或者兽医了解如何应用这些工具做非洲猪瘟的诊断，如荧光定量PCR方法的优点是高通量且灵敏性好，但对实验室和检测人员要求较高；多酶恒温快速扩增技术（MIRA）使核酸检测更加便利，时间短，操作简便，特异性高，缺点是与qPCR相比，成本稍高，灵敏性稍差；ELISA试剂盒检测非瘟抗体，结果稳定，通量高，适合筛查无症状感染猪和康复猪。合理地选择这些非瘟核酸和抗体检测方法，针对不同场景制定不同的检测方案，能起到事半功倍的作用。
1通过系统的生物安全措施阻断非洲猪瘟病毒的场内外传播
生物安全是为降低病原入侵和传播风险而实施的一系列措施集成。“外防输入、内防扩散”包括两层含义。首先是通过外部生物安全措施阻止病毒进场。而病毒一旦突破外防线，进入场内，则需要通过场内生物安全措施把病毒控制在一定范围内不扩散，再通过临床观察与实验室检测进行早期识别，然后快速清除第一发现点的猪群以及通过检测、排查、清除其他可能发生感染的猪群，从而达到净化非洲猪瘟的目的。
1.1场外生物安全要点
场外生物安全的目标是“把非洲猪瘟病毒阻挡在围墙之外”，也就是确保进入或靠近猪场的人、车、物、猪等是安全的。
1.1.1人员：人员进场前一段时间内通常会被要求不能接触各种“风险因素”，然后通过洗澡、更换衣服、隔离等流程才能进场。
1.1.2物资：进场物资需经过多级消毒、静置处理（熏蒸、烘干或浸泡等），紧急物资可以通过专门消毒管控通道进场。
1.1.3车辆：车辆一般需要经过一级洗消点初洗、二级洗消点精洗、消毒、烘干和门卫清洗消毒后才能进场或接近猪场。
1.1.4猪：引进猪和精液是猪场引进病原的最大风险之一，需经过隔离和严格检测，确保安全后才能进场，入场之后需要有专门的隔离单元，方便对猪只进行检测、隔离和驯化。
1.2场内生物安全要点
场内生物安全的目标是“把非洲猪瘟病毒控制在第一感染点”，也就是通过隔离、阻断、清洁和消毒确保进场的病毒在被发现前不出现大范围扩散。
1.2.1分区管理：猪场根据工作区分布情况实施分区管理，一般划分为门卫区、人员隔离区、生活区、生产区和环保区等。生产区再以生产单元为单位划分为若干个区域，比如配怀区、产房区、公猪舍、后备区、保育区和育肥区等。各个区域以实体墙隔断并独立运行。工具、物资和人员等避免交叉，如确需交叉，需要做好清洗消毒工作。
1.2.2生产区最适单元格划分：生产区以最适单元格等进行划分，单元格之间避免交叉，如确需交叉，需要做好清洗消毒工作。
1.2.3净污道路分开：场区内严格划分净道和污道，车辆按照规定路线行驶。净道污道如有交叉，不同的作业则分时段操作，并在操作前后对道路消毒。
1.2.4人员流动：后勤人员跨区流动要进行安全处理，比如进舍要洗澡、换工作服和靴（鞋）子，车辆跨区时要对轮胎消毒。员工出入猪舍应按规定淋浴、换工作服和靴子，舍内、舍外、生活区的衣靴不得交叉。
1.2.5饮水分开：为避免饮水传播病毒，尽量使用深层地下水或者自来水，并避免通槽饮水。
1.2.6定时巡栏：一线人员每天对猪群巡栏至少两次，对所有出现异常表现的猪采样、检测，做到早检测、早发现。一旦非洲猪瘟病毒核酸检测呈阳性，结合临床表现，确认为非洲猪瘟病毒感染，立即启动应急预案。
1.3执行关键点
1.3.1配套的硬件设施是生物安全措施彻底执行的基础。配备必要的工具和设施，减轻工作量，减少操作步骤，才能让执行人员长期稳定地把生物安全做好。另一方面，对硬件设施进行优化设置，减少人员犯错的可能，也很重要。比如建设实体隔断（墙、围挡）阻止人员跨区就比划线警示要靠谱得多。
1.3.2现场带教、培训和定期检查是生物安全措施彻底执行的保障。生物安全是一个系统工程，要求人人遵循，不能有明显的漏洞。而让人人都理解并执行到位，并不是一件容易的事情。通过持续不断地培训提高执行人员的认知，通过定期检查查缺补漏，并建立监督和考核制度，才可能让整体生物安全方案被正确执行。
1.3.3不断地优化和改进是生物安全的灵魂。没有完美的生物安全，只有不断优化和改进的生物安全。定期对每个猪场的生物安全方案和执行情况进行评估，结合现场实际情况进行优化和改进，抓关键点并化繁为简，使生物安全方案更加科学、合理和容易执行。
2增强种群健康、提高病毒感染“阈值”
非洲猪瘟病毒具有典型的“欺软怕硬”的特征。健康度差、处于亚健康状态或应激状态的猪群经常成为受害者。事实证明，提高猪群的整体健康度，大大有利于非洲猪瘟的防控。
2.1增强营养：在非瘟流行以及饲料全面禁抗的背景下，调整饲料配方，增强营养，保证猪群各个阶段营养充分，提高猪群整体抵抗力。
2.2环控保障：千方百计为猪群提供舒适的环境，保证温度适宜、空气新鲜洁净等。
2.3疫病防控：猪场重大疫病的有效防控，尤其是免疫抑制病的控制，是保障猪群健康的基础。净化猪瘟、猪蓝耳病和伪狂犬病等重要疫病，有利于非洲猪瘟的预防和控制。
2.4淘汰弱差：及时淘汰猪群中的弱差猪和亚健康猪，避免这些猪成为病毒感染、增殖和传播的突破口。
3准确及时的检测是预防和清除非洲猪瘟病毒的关键因素
及时准确地给出检测结果，为非瘟防控方案的制定提供强有力的支持，是猪场实验室的核心任务。为了使检测结果准确及时，不同场景下应使用不同的检测方法，并制定差异化的监测预警方案。
3.1荧光定量PCR
首先，通过比对试验和临床使用数据分析，筛选到稳定且灵敏度高的检测试剂盒。荧光定量PCR适合在基础条件较好的实验室进行，适合对时间要求不高，但对敏感性、特异性和批量要求高的样品。适合场景：（1）对临床样品进行批量检测；（2）对临床上其他方法快速检测的样品进行复核检测；（3）对临床疑似样品进行复核检测；（4）对来源于环境等可能是弱阳性的样品进行检测。
3.2核酸快检方法
目前，市场上有不少传统的快速检测试剂，适合在现场进行快速检测，特点是其对实验条件要求不高，操作简便，快速出结果。类似产品在灵敏性、特异性和稳定性上与荧光定量PCR仍有差距，疑似样品通常要送到实验室用荧光定量PCR方法复核。用多酶恒温快速扩增技术（MIRA）研发的新型非瘟核酸快速检测试剂盒，20分钟左右核酸扩增出结果，灵敏性虽稍差于荧光定量PCR，但特异性很高，仪器设备简单，操作方便，适合现场急需结果的场景，比如急于运行的车辆、急于进场的人员以及感染场疑似猪群的快速现场筛查等。其缺点是成本高。笔者用荧光定量PCR与MIRA快检方法分别检测了包括全血和血清等在内的各种类型的样品，对于荧光定量PCR的CT值在38以下的样品，MIRA能够稳定检测出来，部分数据对比结果见表1。
表1 qPCR与MIRA检测数据对比
3.3抗体检测
对可疑猪群进行跟踪检测时，通常会检测非瘟抗体，结合核酸检测结果，作出临床判断。
部分应用场景：（1）核酸检测存疑暂时无法确诊时，可结合抗体检测作出判断；（2）结合核酸检测确认猪群是否存在变异毒株感染；（3）筛查猪群中是否存在感染康复猪或无症状感染猪。
抗体筛查方案：（1）抗体检测的灵敏性和特异性虽不如荧光定量PCR，但是抗体产生后相对稳定，临床中可以和病原检测结合使用，两种方法相辅相成；（2）筛查猪群中的康复猪或无症状感染猪，要选择高灵敏度的试剂盒，以免漏检。这类试剂盒会有一定比例的假阳性（比如3%～5%），对阳性和可疑结果可选用另一种抗体检测试剂盒做复核检测，然后再持续跟踪检测可疑猪群，直至风险完全解除；笔者在临床实践中使用一种国外品牌非瘟抗体检测试剂盒筛查临床血清，并用国内某品牌试剂盒对筛查的可疑及阳性样品进行复核，并持续跟踪检测被采样的猪及猪群，以确认样品的阴阳性。数据显示，用于抗体筛查的国外品牌试剂盒的假阳性率约为4.8%，如图1所示；（3）对于筛查及复核确认的阳性样品，可检测CD2v抗体，以鉴定感染毒株的CD2v基因是否发生大的变异或缺失；（4）还有一种非瘟抗体检测试剂盒，其检测的抗体不针对p72、p54和p30等常用来研制亚单位疫苗的抗原，因此可以用来区分亚单位疫苗免疫猪和病毒感染猪，作为一种技术储备，值得关注；（5）临床应用案例分析：笔者应用上述方案检测临床样品，观察并证实了多种情况，可见临床样品复杂多样。非瘟抗体总体检测策略及临床检测到的典型样品见表2。
图1某国外品牌非瘟抗体检测试剂盒筛查临床血清样品结果分析
表2非瘟抗体检测方案及结果分析
注：*：区分亚单位疫苗免疫抗体与病毒感染抗体；
#：CD2v发生大的变异或缺失毒株；
&：抗体的结果分析仅供参考，疑似和可疑样品需要持续跟踪检测；
+：阳性，-：阴性，+/-：疑似，N：不做。
4总结非
控制传染源、切断传播途径和保护易感者，是控制传染病流行的关键环节。对疑似感染猪进行隔离、对确诊的感染猪进行无害化处理是控制传染源；分区管理，空气过滤，实体隔断，饮水、环境、物资和工具消毒，防鸟、蚊蝇和老鼠等都是切断传播途径；加强营养、改善环境、提升猪群特异性或非特异性免疫力等是保护易感动物。从广义上来讲，所有这些保护猪群的措施都属于生物安全范畴。因此，对于“防非”，除了生物安全，似乎没有更好的选择。织密生物安全体系之“天网”，可以阻断病毒入侵和扩散；而打造灵敏的检测体系则是安装疫病防控之“鹰眼”，便于及时发现和清除“隐患”及“病灶”。生物安全体系和监测预警体系都是系统工程，在实际操作过程中，要依据猪场的优势、特点和实际情况，选择适合本场的方案。
专家点评
自2018年我国发生非洲猪瘟以来，猪场的生物安全被提到了前所未有的高度，尤其是一些大型养殖集团和规模化猪场，都快速建立猪场内外生物安全体系，这对于控制非瘟病毒的传播起到了重要的作用。李国新研究员自2019年以来深入生产一线参与非洲猪瘟的防控，积累了丰富的现场经验，结合严谨的科研思维，总结出一套可行的生物安全防控措施和贴近生产实际的实验室非洲猪瘟检测方案。首先，作者阐述猪场内外的生物安全设计和管理以阻断非洲猪瘟病毒进入猪场，重点强调一线人员执行力对于生物安全有效性的作用，比如设施如何人性化的设计以便于一线员工执行生物安全，如何通过现场带教、培训和定期检查对生物安全的执行进行纠偏，定期对每个猪场的生物安全方案和执行情况进行评估，结合现场实际情况进行优化和改进，抓关键点并化繁为简，使生物安全方案更加科学、合理和容易执行。其次，作者简要介绍通过饲养管理和疫病防控如何保护易感动物，比如对猪群提供高营养水平的饲料、良好的环境控制管理、其他动物疫病防控及淘汰健康度差的易感猪只等。最后，通过不同诊断方法在非洲猪瘟检测对比及其应用的场景介绍，让养猪生产者或者兽医了解如何应用这些工具做非洲猪瘟的诊断，如荧光定量PCR方法的优点是高通量且灵敏性好，但对实验室和检测人员要求较高；多酶恒温快速扩增技术（MIRA）使核酸检测更加便利，时间短，操作简便，特异性高，缺点是与qPCR相比，成本稍高，灵敏性稍差；ELISA试剂盒检测非瘟抗体，结果稳定，通量高，适合筛查无症状感染猪和康复猪。合理地选择这些非瘟核酸和抗体检测方法，针对不同场景制定不同的检测方案，能起到事半功倍的作用。
