摘要：为了解目前已上市的腹泻活疫苗的效果，分别从市场上购买几种腹泻活疫苗，分别对这几种腹泻活疫苗进行病毒含量检测及生产毒株测序分析。试验结果表明：华派生物工程集团有限公司生产的“胃腹流康”二联活疫苗，其病毒含量、生产用毒株与流行的匹配性等方面均表现优秀。
关键词：腹泻活疫苗；猪流行性腹泻病毒（PEDV）；猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）
腹泻是目前给我国养猪业造成巨大经济损失的三大主要疾病之一，引起猪群腹泻的因素较多，危害最为严重的病毒性因素主要是猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒，两种病毒既可单一感染也可混合感染。PEDV和TGEV在全世界范围内广泛流行，在我国猪场的感染非常严重，各种年龄的猪群均可感染发病，尤以哺乳仔猪感染后的严重程度最高，死亡率可达90%及以上。目前尚无治疗猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎的特效药物，因此通过接种疫苗降低PEDV和TGEV的感染风险，从而达到防控两种疾病的目的，成为最为经济有效且可靠的方法。
弱毒疫苗是采用致病力减弱后的毒株制作而成的活疫苗，在保留病毒的感染性的同时，削弱了病毒的致病力。这类疫苗中的弱毒株可以在注射进入机体后，可在机体内持续繁殖且刺激机体产生持续的免疫力的提点，因此在临床上经常使用。使用弱毒疫苗用于防控PEDV和TGEV时，疫苗中病毒含量是影响疫苗免疫效果的关键。此外近年来，随着猪流行性腹泻疫情的爆发，我国流行的PEDV毒株与经典毒株相比，在不同的基因微店发生了特征性突变，现在的PEDV毒株在抗原位点发生了变异，因此疫苗毒株与流行毒株相匹配才能更有效地为猪只提供有效的免疫保护。鉴于此，本研究对目前我国已批准生产上市的腹泻活疫苗的病毒含量及毒株序列进行比对分析，以指导养殖户更好的选择适合自家猪场的疫苗。
1 材料
1.1 疫苗 从市场上购买市售的4种腹泻活疫苗；从华派生物工程集团有限公司生产的“胃腹流康”疫苗中随机抽取一批进行检验。
1.2 细胞 Vero细胞及ST细胞，由华派生物工程集团有限公司保管及供应。
1.3 引物及探针 由生工生物工程（上海）有限公司合成。
1.4 主要试剂 TRIzol™ LS Reagent购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；高效率逆转录试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)购自宝日医生物技术（北京）有限公司。
2 方法
2.1 盲样设置 将每种疫苗原始标签去掉后，随机标为疫苗A、疫苗B、疫苗C、疫苗D和疫苗E，再交由检测人员进行检测。
2.2 疫苗检测
2.2.1 病毒含量测定（细胞测定法） 分别将5种活疫苗稀释至1头份/ml，再使用Vero细胞进行PEDV病毒含量的测定，使用ST细胞进行TGEV病毒含量的测定，计算每头份疫苗中所含的PEDV及TGEV的病毒含量。
2.2.2 病毒含量测定（荧光定量PCR测定法） 分别将5种活疫苗稀释至1头份/ml，使用探针法对5种活疫苗进行检测。
2.2序列测定及比对分析
2.2.1 TGEV测序及比对分析 使用TrizolA+提取5种活疫苗的RNA，使用TGEV S1基因特异性引物进行RT-PCR，扩增得到的阳性PCR产物送往生工生物工程（上海）有限公司进行测序，并对5种活疫苗的TGEV的测序结果进行同源性分析。
2.2.2 PEDV测序及比对分析 使用TrizolA+提取5种活疫苗的RNA，使用PEDV S1基因变异区特异性引物进行RT-PCR，扩增得到的阳性PCR产物送往生工生物工程（上海）有限公司进行测序。将5种疫苗疫苗的PEDV的测序结果进行同源性分析，同时与近5年来华派生物工程集团有限公司检测并收集到的PEDV阳性病毒毒株序列进行比对分析。
3 结果
3.1 细胞法测定病毒含量结果
3.1.1 PEDV含量测定结果 经测定，5种活疫苗中PEDV含量为105.8TCID50/头份~106.4TCID50/头份，其中疫苗中PEDV含量最高的为疫苗C，最低的为疫苗B。结果见表1。
表1 PEDV含量测定结果（细胞法）
3.1.2 TGEV含量测定结果 经测定，5种活疫苗每头份疫苗中的TGEV含量含量为105.6TCID50/头份~106.5TCID50/头份，其中每头份疫苗中TGEV含量最高的为疫苗D和疫苗E，最低的为疫苗B。结果见表2。
表2 TGEV含量测定结果（细胞法）
3.2 荧光定量法测定病毒结果
3.2.1 PEDV检测结果 使用探针法对5种腹泻活疫苗中的PEDV进行测定，结果Ct值为17.67~25.07，Ct值最低的为疫苗C，Ct值最高的为疫苗E。结果见表3。Ct值越低，代表着起始浓度中的病毒核酸浓度相对越高，Ct值越高，代表起始浓度中的病毒核酸浓度相对越低。根据Ct值结果，疫苗C中的PEDV病毒核酸相对最高，疫苗E中的PEDV病毒核酸相对最低。
表3 PEDV荧光定量检测法测定结果
3.2.2 TGEV检测结果 使用探针法对5种腹泻活疫苗中的TGEV进行测定，结果Ct值为17.63~22.05，Ct值最低的为疫苗D，Ct值最高的为疫苗B。结果见表4。Ct值结果表明，疫苗D中的TGEV病毒核酸相对最高，疫苗B中的TGEV病毒核酸相对最低。
表4 TGEV荧光定量检测法测定结果
3.3 测序及比对分析
3.3.1 TGEV测序及比对分析 对5种腹泻活疫苗中的TGEV毒株进行测序，并进行比对分析，结果5种腹泻疫苗中的TGEV毒株的同源性高，差异较小。结果见图1。
图1 5种疫苗TGEV毒株的同源性分析
3.3.2 PEDV测序及比对分析 对5种腹泻活疫苗中的PEDV毒株测序，并进行比对分析，结果5种腹泻疫苗中的PEDV毒株的差异较大，其中疫苗C和疫苗E的同源性为100%，但两者与其余3种疫苗的同源性较差。结果见图2。此外将这种疫苗PEDV毒株序列与PEDV 经典毒株CV777毒株以及2018至2020年部分PEDV流行毒株序列（这些PEDV流行毒株由华派生物工程集团有限公司诊断中心检测收集，病料采集自全国各地发生腹泻的猪场），结果见图3。结果表明，疫苗C和疫苗E与CV777毒株的亲缘关系近，但与近年来的PEDV流行毒株亲缘关系较远，疫苗D与今年来的PEDV流行毒株的亲缘关系较近。
图2 5种腹泻活疫苗PEDV毒株同源性分析
图3 5种疫苗的PEDV毒株与近年来的PEDV流行毒株进化关系图
4 小结及讨论
本研究分别对5种已批准上市的腹泻活疫苗进行比对，分别对疫苗中PEDV和TGEV含量进行测定，并对疫苗PEDV毒株和TGEV毒株进行测序比对分析。
在对疫苗PEDV和TGEV病毒含量进行测定时，分别采用了细胞法和荧光定量PCR测定法。细胞法可以测定疫苗中具有感染性的病毒粒子（也就是我们俗称的“活病毒”）的数量，更能直接有效的反映疫苗中的病毒含量，但是细胞测定病毒含量耗时长，对环境和操作者的要求高；荧光定量PCR检测法测定病毒含量时，测定的为疫苗中所含病毒的核酸数量，只能间接反映疫苗中所含病毒的数量，但操作更为简便，且能更快的得出结果。因此采用两种方法检测同样的疫苗时，细胞法和荧光定量PCR检测结果有所差异。
疫苗毒株与流行毒株的匹配度高，其接种动物后产生的免疫保护力对流行毒株的攻毒保护相应更高，由于目前我国流行的PEDV毒株与早年间流行的毒株相比较，其S基因发生了变异，因此在选择疫苗时应选择与目前流行的PEDV毒株亲缘关系更近的毒株。
在对5种疫苗检测完毕后，对疫苗进行揭盲，其中疫苗D为华派生物工程集团有限公司生产的“胃腹流康”二联活疫苗，该疫苗中所含的PEDV和TGEV的病毒含量，无论使用细胞法或荧光定量PCR方法进行检测时，其结果均处于较高水平。此外，“胃腹流康”中的PEDV毒株与近年来流行的PEDV毒株的同源性高，亲缘关系近，能很好的抵抗现在流行毒株的攻毒。实验结果表明，“胃腹流康”在几种腹泻活疫苗中的对比中，各方面均表现为优秀，可以作为养猪场用于预防控制猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎的首选疫苗。
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