猪肺炎支原引起猪的慢性呼吸道感染，主要通过直接接触和垂直传播（母猪-小猪）。本研究的目的是监测评估后备母猪自然感染猪肺炎支原的动态和持续性。从猪肺炎支原阳性农场挑选了44头20日龄的后备母猪。从第20日龄开始，每30天采集一次咽拭子，通过实时PCR检测猪肺炎支原体，每头后备猪共采集12次样本。在断奶前一天，通过咽拭子对这些母猪所生小猪进行取样，以评估母猪对小猪的传播。对12次样本中的每次样本的猪肺炎支原流行率进行了评估，并进行了多重比较试验和Bonferroni校正。后备母猪的细菌检出始于110日龄（doa），在140日龄时显著增加（p<0.05）。猪肺炎支原体的流行率在140至230 doa期间保持在20%以上，此后有所下降。然而，在110 doa之后的任何采样中，都没有达到0%。在这项研究中，断奶前仔猪样本中未检测到猪肺炎支原。这个猪肺炎支原体检测模式显示，自然感染的后备母猪呈现1~3个月的猪肺炎支原阳性，但偶尔可能会出现更长时间的阳性。此外，在整个研究过程中，18.2%的后备母猪没有检测到猪肺炎支原，这表明阳性群体中存在阴性亚群。
1、引言
猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhy），导致猪的慢性支气管肺炎（地方性肺炎；Goodwin等，1965；Mare和Switzer，1965），是猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的主要病原之一，给世界养猪业造成了巨大的损失（Thacker和Minion，2012）。Mhy引起的感染被认为是猪呼吸道感染中最常见的细菌性感染，并且是慢性感染。
Mhy的传播主要发生在年龄或者生产阶段相近的猪的直接接触（Clark等，1993；Fano等，2005），以及从母猪垂直穿给仔猪（Calsamiglia和Pijoan，2000）。尽管Mhy的传播率很低（Meyns等，2004；Pieters等，2010；Villarreal等，2011），但是他足以使感染在猪群中维持。猪一旦感染，排菌可达214天，甚至成为无症状携带者，并可以感染易感猪（Pieters等，2009）。这这一特征对于长期处于猪群内的动物尤其重要，繁殖母猪群便是这类动物。
确定Mhy在繁殖猪群中的实际感染和排菌时间点，对于了解疾病在母猪群的传播和新生仔猪暴露和感染的可能性是非常重要的。例如，Dee等人与1996年描述的，在PRRSV地方性流行的猪场中，母猪存在不同的感染状态，这一现象表面了母猪群众中存在阴性亚群。这种阴性群体的存在被认为是病毒持续传播的一个风险点。因此，感染的关键机会点的清晰界定，是防控措施制定和实施的关键。
使用PCR在活猪上检测Mhy，为该菌的感染动力学提供了信息，因为即便在血清转阳前也能识别感染猪（Calsamiglia等，1999；Roos等，2016；Pieters等，2017），或者观察到临床症状前（Pieters和Pijioan，2006）。此外，喉拭子（Pieters等，2017）、支气管粘液样本（Vangroenweghe等，2015）和支气管拭子（Fablet等，2010）的使用改善了PCR在活猪上检测Mhy的敏感性。
结合敏感性诊断的纵向研究是提供群体感染动力学信息的有用工具，同时有助于实施疾病缓解措施，如管理实践、免疫、药物治疗和清楚（Maes等，2008）。然而，用于检测Mhy的高灵敏活体采样技术，如喉拭子，也仅仅是近年才普及并得到验证，据我们所知，目前的文献中，缺乏包括感染急性期和慢性期采样的系统性田间研究。因此，本研究的目的是评估后备母猪自然感染Mhy后的检出动态和感染持续情况。
2、材料方法：
2.1道德声明
参与研究的农场遵循他们自己的管理原则。此外，此外，本研究涉及的所有采样方案，均已获得南里奥格兰德联邦大学动物伦理与实验动物管理委员会的批准。
2.2动物与饲养
从猪肺炎支原体阳性扩繁猪场选择80头20日龄的后备母猪（长白×大白）。农场的选择是基于呼吸道临床症状和实验室诊断。简单地说，与主治兽医讨论后，通过观察临床症状（干咳）得出了存在呼吸道疾病。此外，还进行了包括血清学和肺部病变评估在内的诊断测试。该农场位于巴西南部，该国大部分猪肉生产都在这里进行。从选择的那一天到第一次断奶前一天，即326–358日龄（doa），对这些后备母猪进行跟踪研究。整个研究，后备母猪被安置在三个不同的地点（图1）：a）繁殖群（1500头母猪）：从出生到63 doa。b）育肥单元（1400头后备母猪）：从63 doa到168 doa（距离繁殖群65公里）。c）分娩单元（1800头母猪）：从169 doa到配种（约210 doa）、分娩（约324 doa）或断奶（位于距离育肥单元500米的地方）。选定的母猪在21 doa断奶，并与未纳入本研究的同一批次的其他母猪一起饲养在三到五个栏中（分别为保育、育肥或产仔单元，直至首次配种）。该研究于2016年10月至2016年9月进行。
1、引言
猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhy），导致猪的慢性支气管肺炎（地方性肺炎；Goodwin等，1965；Mare和Switzer，1965），是猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的主要病原之一，给世界养猪业造成了巨大的损失（Thacker和Minion，2012）。Mhy引起的感染被认为是猪呼吸道感染中最常见的细菌性感染，并且是慢性感染。
Mhy的传播主要发生在年龄或者生产阶段相近的猪的直接接触（Clark等，1993；Fano等，2005），以及从母猪垂直穿给仔猪（Calsamiglia和Pijoan，2000）。尽管Mhy的传播率很低（Meyns等，2004；Pieters等，2010；Villarreal等，2011），但是他足以使感染在猪群中维持。猪一旦感染，排菌可达214天，甚至成为无症状携带者，并可以感染易感猪（Pieters等，2009）。这这一特征对于长期处于猪群内的动物尤其重要，繁殖母猪群便是这类动物。
确定Mhy在繁殖猪群中的实际感染和排菌时间点，对于了解疾病在母猪群的传播和新生仔猪暴露和感染的可能性是非常重要的。例如，Dee等人与1996年描述的，在PRRSV地方性流行的猪场中，母猪存在不同的感染状态，这一现象表面了母猪群众中存在阴性亚群。这种阴性群体的存在被认为是病毒持续传播的一个风险点。因此，感染的关键机会点的清晰界定，是防控措施制定和实施的关键。
使用PCR在活猪上检测Mhy，为该菌的感染动力学提供了信息，因为即便在血清转阳前也能识别感染猪（Calsamiglia等，1999；Roos等，2016；Pieters等，2017），或者观察到临床症状前（Pieters和Pijioan，2006）。此外，喉拭子（Pieters等，2017）、支气管粘液样本（Vangroenweghe等，2015）和支气管拭子（Fablet等，2010）的使用改善了PCR在活猪上检测Mhy的敏感性。
结合敏感性诊断的纵向研究是提供群体感染动力学信息的有用工具，同时有助于实施疾病缓解措施，如管理实践、免疫、药物治疗和清楚（Maes等，2008）。然而，用于检测Mhy的高灵敏活体采样技术，如喉拭子，也仅仅是近年才普及并得到验证，据我们所知，目前的文献中，缺乏包括感染急性期和慢性期采样的系统性田间研究。因此，本研究的目的是评估后备母猪自然感染Mhy后的检出动态和感染持续情况。
2、材料方法：
2.1道德声明
参与研究的农场遵循他们自己的管理原则。此外，此外，本研究涉及的所有采样方案，均已获得南里奥格兰德联邦大学动物伦理与实验动物管理委员会的批准。
2.2动物与饲养
从猪肺炎支原体阳性扩繁猪场选择80头20日龄的后备母猪（长白×大白）。农场的选择是基于呼吸道临床症状和实验室诊断。简单地说，与主治兽医讨论后，通过观察临床症状（干咳）得出了存在呼吸道疾病。此外，还进行了包括血清学和肺部病变评估在内的诊断测试。该农场位于巴西南部，该国大部分猪肉生产都在这里进行。从选择的那一天到第一次断奶前一天，即326–358日龄（doa），对这些后备母猪进行跟踪研究。整个研究，后备母猪被安置在三个不同的地点（图1）：a）繁殖群（1500头母猪）：从出生到63 doa。b）育肥单元（1400头后备母猪）：从63 doa到168 doa（距离繁殖群65公里）。c）分娩单元（1800头母猪）：从169 doa到配种（约210 doa）、分娩（约324 doa）或断奶（位于距离育肥单元500米的地方）。选定的母猪在21 doa断奶，并与未纳入本研究的同一批次的其他母猪一起饲养在三到五个栏中（分别为保育、育肥或产仔单元，直至首次配种）。该研究于2016年10月至2016年9月进行。
图1实验设计和饲养位置的图示
数字表示采集样本时的日龄（doa）。从20 doa开始，直到断奶前一天，每30天采集一次咽拭子，并进行猪肺炎支原体实时PCR检测，共12次采样（黑点）。在断奶前一天，对每头后备母猪所产仔猪随机5头小猪进行取样，以评估母猪对小猪的传播。
猪肺炎支原体的疫苗免疫方案包括在21和150 doa两剂商业疫苗。此外，后备母猪在21 doa接种了2型猪圆环病疫苗。本研究的农场感染了多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和甲型流感病毒（IAV），亚临床感染了PCV-2，但PRRSv呈阴性。每窝5头，总计从这些分娩的后备母猪中选择220头小猪，用于这项研究。
作为农场管理的一部分，在研究中对后备母猪进行了抗生素治疗。总之，在保育和育肥阶段，对后备母猪进行了抗生素治疗。抗生素与抗支原体的药物一起在饲料中施用。小猪在任何时候都没有接受影响支原体的抗生素治疗。
2.3实验设计
在研究开始时，随机选择后备母猪并打耳标。每30天从母猪身上采集一次咽拭子，既每头后备母猪采集12次样本，通过实时PCR检测猪肺炎支原体（图1）。断奶前一天对仔猪采集咽拭子，以评估母猪-仔猪的传播。在本研究过程中，不允许交叉饲养，以保证在其生物学采样仔猪对应母猪。
2.4样本采集
使用无菌人造棉签（Laboclin®，Pinhais，PR，Brazil）在口腔塞和喉镜得帮助下，插入口腔，直到它们到达喉部，从后备母猪及其所产5头小猪身上采集咽拭子（Pieters等人，2017）。所有拭子都贴上标签，冷藏运输，并在−20°C下储存在实验室中，直到进行DNA提取。
2.5样本处理和检测
Mhy的实时PCR方法：用QIAAMP DNA MINI试剂盒，按照说明书从喉拭子中提取DNA™（QIAGEN®，Hilden，德国）。按Duboseon等人（2004）先前描述的引物进行Mhy的实时PCR。总之，总体积为25μL，并用Fast Software 2.3（Applied Biosystems™,美国加利福尼亚州福斯特市）。Ct值≤39.5时认为样品是Mhy阳。
2.6统计分析
后备母猪中Mhy的流行率在12个样本中的每一个样本中估计的。流行率估计是基于实时PCR阳性后备母猪数量比采样的后备母猪总数。在R v3.2（R核心团队，2015）中进行了Bonferroni校正的多重比较试验，以通过实时PCR在不同采样点比较猪肺炎支原体的流行率。
3、结果：
3.1后备母猪咽拭子中Mhy的检测
在将150 doa后备母猪转移到产仔猪场之前，本研究中的一部分母猪是基于它们不符合遗传选择标准而被淘汰。在150 doa，共有36头（45%）母猪被淘汰或没有存活。因此，最初参与研究的后备母猪中55%（44/80）进行了12次采样。从研究开始到结束，共采集了528份样本，获得了44头后备母猪的结果。
后备母猪中所有样本的Mhy流行率如图2所示。在20、50和80 doa的三次采样中，未在后备母猪中检测到Mhy。首次在后备母猪检测到Mhy发生在110 doa流行率为11.4%（5/44）。Mhy流行率从110 doa（11.4%）到140 doa（36.4%；p<0.05显著增加，此后逐渐下降，尽管在随后的任何采样中Mhy的流行率都没有达到0（110–326/358 doa）。在比较所有后续采样的母猪样本Mhy流行率时，没有观察到统计学差异。在任何采样中，Mhy的流行率均不超过36.4%。
猪肺炎支原体的疫苗免疫方案包括在21和150 doa两剂商业疫苗。此外，后备母猪在21 doa接种了2型猪圆环病疫苗。本研究的农场感染了多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和甲型流感病毒（IAV），亚临床感染了PCV-2，但PRRSv呈阴性。每窝5头，总计从这些分娩的后备母猪中选择220头小猪，用于这项研究。
作为农场管理的一部分，在研究中对后备母猪进行了抗生素治疗。总之，在保育和育肥阶段，对后备母猪进行了抗生素治疗。抗生素与抗支原体的药物一起在饲料中施用。小猪在任何时候都没有接受影响支原体的抗生素治疗。
2.3实验设计
在研究开始时，随机选择后备母猪并打耳标。每30天从母猪身上采集一次咽拭子，既每头后备母猪采集12次样本，通过实时PCR检测猪肺炎支原体（图1）。断奶前一天对仔猪采集咽拭子，以评估母猪-仔猪的传播。在本研究过程中，不允许交叉饲养，以保证在其生物学采样仔猪对应母猪。
2.4样本采集
使用无菌人造棉签（Laboclin®，Pinhais，PR，Brazil）在口腔塞和喉镜得帮助下，插入口腔，直到它们到达喉部，从后备母猪及其所产5头小猪身上采集咽拭子（Pieters等人，2017）。所有拭子都贴上标签，冷藏运输，并在−20°C下储存在实验室中，直到进行DNA提取。
2.5样本处理和检测
Mhy的实时PCR方法：用QIAAMP DNA MINI试剂盒，按照说明书从喉拭子中提取DNA™（QIAGEN®，Hilden，德国）。按Duboseon等人（2004）先前描述的引物进行Mhy的实时PCR。总之，总体积为25μL，并用Fast Software 2.3（Applied Biosystems™,美国加利福尼亚州福斯特市）。Ct值≤39.5时认为样品是Mhy阳。
2.6统计分析
后备母猪中Mhy的流行率在12个样本中的每一个样本中估计的。流行率估计是基于实时PCR阳性后备母猪数量比采样的后备母猪总数。在R v3.2（R核心团队，2015）中进行了Bonferroni校正的多重比较试验，以通过实时PCR在不同采样点比较猪肺炎支原体的流行率。
3、结果：
3.1后备母猪咽拭子中Mhy的检测
在将150 doa后备母猪转移到产仔猪场之前，本研究中的一部分母猪是基于它们不符合遗传选择标准而被淘汰。在150 doa，共有36头（45%）母猪被淘汰或没有存活。因此，最初参与研究的后备母猪中55%（44/80）进行了12次采样。从研究开始到结束，共采集了528份样本，获得了44头后备母猪的结果。
后备母猪中所有样本的Mhy流行率如图2所示。在20、50和80 doa的三次采样中，未在后备母猪中检测到Mhy。首次在后备母猪检测到Mhy发生在110 doa流行率为11.4%（5/44）。Mhy流行率从110 doa（11.4%）到140 doa（36.4%；p<0.05显著增加，此后逐渐下降，尽管在随后的任何采样中Mhy的流行率都没有达到0（110–326/358 doa）。在比较所有后续采样的母猪样本Mhy流行率时，没有观察到统计学差异。在任何采样中，Mhy的流行率均不超过36.4%。
图2
图2通过rt-PCR检测，从20日龄（doa）到断奶前一天（326–358 doa），后备母猪（n=44）Mhy的流行率。每30天采集一次后备母猪咽拭子，rt-PCR检测猪肺炎支原体。*代表与后一采样点之间结果存在统计学差异（p<0.05）。使用多重比较试验和Bonferroni调整对所有样本的Mhy流行率进行比较。图中显示了每个采样点的流行率。
图3
图3 rt-PCR检测所有样本中检出Mhy阳性的后备母猪（n=44）的示意图。从20 doa到断奶前一天（326–358 doa），每30天采集一次咽拭子。每个黑框代表一个阳性样本。
评估了每头后备母猪中Mhy的检出模式，其分布如图3所示。在整个研究过程中，8头后备母猪（18.2%）在所有采样中连续呈阴性，34.1%（15/44）仅一次阳性，22.7%（10/44）两次阳性，20.4%（9/44）三次阳性，2.3%（1/44）四次阳性，以及2.3%（1/4）五次阳性。27.3%的母猪（12/44）不连续的超过1次呈阳性。
3.2仔猪咽拭子
在断奶前一天，对研究中44母猪所生的220头（每窝5头）小猪进行了采样。所有仔猪的喉拭子PCR检测结果均为阴性。
4、讨论
本文描述了一项纵向研究，旨在评估44头后备母猪体内Mhy自然感染的检出模式。从20 doa到断奶前一天（326–358 doa），每30天采集一次咽拭子，共处理528个样本，使用实时PCR检测Mhy。结果显示，从110 doa开始检测到Mhy，与前面采样点相比，流行率在140 doa显著增加。Mhy的流行率在140~230 doa期间保持在20%以上。尽管230 doa后Mhy流行率较低，但在110 doa后的所有采样点中，其流行率均未达到0%。值得注意的是，所选后备母猪所产仔猪中，断奶前，仍由母猪泌乳饲养阶段，均未检测到Mhy。此外，本研究还评估了后备母猪中Mhy检测模式，提供了有关Mhy检测动态持续时间的信息，可能包括感染的急性和慢性阶段。
尽管已知这些动物来自一个地方性感染的农场，但在20、50和80 doa的任何一头后备母猪中都没有检测到Mhy。Mhy的检出从110 doa开始，在140 doa时流行率显著增加。来自不同农场的后备母猪直接接触导致传播的增加并不能解释流行率的增加，因为这些后备母猪只会与来自同一猪场的同一批后备猪饲养在一起。据推测，这些后备母猪已经被Mhy定植，因为它们来自同一个地方性感染的农场，但在早期时没有被检测到。鼻拭子已被广泛用于猪肺炎支原体的检测，尤其是对仔猪。然而，鼻腔中的细菌脱落可能是间歇性的（Pieters和Pijoan，2006），这影响测试灵敏度。另一方面，气管支气管（Kurth et al.，2002；Fablet et al.，2010）和喉部（Sievers et al.，2015；Pieters et al.，2017）位点似乎在断奶后和育肥猪中Mhy的检测最敏感。尽管喉拭子检测方法具有明显高灵敏度，但研究认为，只有Mhy病原数量达到临界值时，才能通过活体采样并检测出Mhy。Mhy在下呼吸道的增殖足够多之前，这种细菌似乎不会到达喉部，因为Mhy的感染是缓慢的，并且在自然感染早期，喉部的细菌载量可能仍未被发现。
尽管知道Mhy的排菌和传播可能在实验性感染中长达214天（Pieters等人，2009），但这项研究的结果表明，在自然感染中，后备母猪Mhy阳性可能持续1~3个月，但偶尔可能会更长时间的检出（4~5个月）。在实验条件下，Mhy的排菌时间可能更长，这是因为猪气管内接种了高浓度的病原菌。另一方面，在自然感染中，主要传播途径是鼻-鼻接触，病原载量可能较低。此外，值得注意的是，本研究仅对活猪进行Mhy检测评估，这与Pieters等人进行高敏感传播实验和剖检检测存在差异（2009）。
在整个研究过程中，18.2%的后备母猪未检出Mhy，这一现象可以用该病原菌传播率低来解释（Meyns等人，2004；Pieters等人，2010年；Villarreal等人，2011年）。这表明，并非所有的后备母猪都会在同一时间被感染，并被检测出阳性，即使在地方性感染群体中，依然存在阴性的后备母猪，这些猪仍然是Mhy的易感染猪。未感染的后备母猪亚群，会使病原在群内持续循环传播，进而长期维持Mhy感染状态。Dee等人（1996），通过血清学方法持续评估了PRRSv地方性畜群6个月，检测出20-25%的阴性母猪亚群。在这项研究中，尽管对后备母猪进行了一年跟着并通过实时PCR检测，但仍检测到了类似比例的Mhy阴性后备母猪。据我们所知，这是第一次表明在阳性繁殖群中存在Mhy阴性亚群的研究。基于这些结果，可以建议使用驯化方案，以便在早期暴露所有后备母猪，以确保它们在第一次分娩前痊愈并停止排菌（Pieters和Fano，2016），即使是来自Mhy阳性农场的后备母猪。此外，Mhy脱落可能主要发生在感染的急性期，而在后备母猪慢性感染期无法检测到（Pieters等人，2009），这可能也发生在本研究中。
本研究中，27.3%的后备母猪间歇性的检出Mhy。这可能是由于阳性后备母猪的检测失败，因为自然感染猪的喉拭子灵敏性并不完美（Roos等人，2016）。另一种可能的解释是再次感染不同毒株的Mhy菌株。人们已经知道在农场见存在不同毒株的循环（Vranckx等，2011；Dos Santos等，2015；Pantojia等，2016），并且不同毒株间可能没有交叉保护（Villarreal等，2009）。本研究中，随着时间的推移，后备母猪中检测到多样性的特征是有价值的，然而大多数样本DNA浓度不足以进行测试。
尽管所有的后备母猪免疫了两次Mhy疫苗，并且最后一次免疫是在150日龄，但是正如过去的文献材料（Meyns等，2006；Pieters等，2010；Villarreal等，2011），免疫并能阻止Mhy的感染。另一方面，疫苗免疫可以显著降低猪群的感染压力。已有研究证实，与未免疫猪相比，免疫并感染后的猪群，其病毒载量更低，临床症状更少（Vranckx等，2012；Woolley等，2014；Fano和Cline，2016）。
抗生素治疗可以降低呼吸道内Mhy的载量（Vicca等，2005），改善Mhy感染导致的生产性能、减少病变和临床症状（Vicca，2005）。然而，抗生素治疗并能清楚呼吸道内的Mhy（Le Carrou等，2006；Painter等，2012）。本研究中后备母猪使用抗生素，有可能影响了Mhy的排菌，从而影响了喉拭子样本中的检测结果。然而，即便在使用抗生素期间，后备母猪Mhy阳性率率依然从110日龄~170日龄持续上升，因此可以推断，在本研究条件下，抗生素处理对后备母猪中Mhy检出的影响非常微小。
本研究中，没有检测到Mhy通过母猪传给小猪，尽管在小猪采样的同时有一头母猪检测到阳性。已有研究表明：在分段隔离饲养模式下，仔猪群早期Mhy阳性检出比例极低，而日龄偏大阶段定植感染猪数量会出现陡然上升（Sibila等，2004；Giacomini等，2016）。
5、结论
在本研究条件下，猪肺炎支原体的活体检出规律表明，自然感染的后备母猪，猪肺炎支原体检出阳性的时长多为1～3个月，同时也存在长期带菌检出的情况，只是检出频率更低。此外，相当比例的后备母猪始终未检测到猪肺炎支原体，证实阳性感染猪场内部存在阴性亚群。
