1 主题内容与适用范畴

　　本标准规定了饲料中维生素B2测定方法。
　　本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素B2的测定。待测液中维生素B2检测浓度为0.05～0.2μg／mL。

    2 引用标准

　　GB 6682 实验室用水规格

    3 方法原理

　　维生素B2（即核黄素C17H20N1O6）在440nm紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范畴内其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比值，运算 样品核黄素的含量。

    4 试剂和溶液

　　除尤其 规定外，本标准所用试剂均为估量 纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。
    4.1 盐酸溶液，0.1mol／L：将8.5mL盐酸（GB 622）用水稀释至1000mL。
    4.2 盐酸溶液，1mol／L。
    4.3 氢氧化钠（GB 629）溶液，1mol／L。
    4.4 冰乙酸（GB 676）。
    4.5 冰乙酸溶液，0.02mol／L：将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。
    4.6 高锰酸钾（GB 643）溶液，40g／L。
    4.7 过氧化氢（HG 3─1082）溶液，100mL／L。现用现配。
    4.8 核酸素标准溶液
    4.8.1 核黄素贮备液Ⅰ：核黄素（中国药典参照标准），于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于0.02mol／L乙酸溶液（4.5）中，在蒸汽浴上恒速搅动直至溶解，冷却后稀释至500mL。盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖，低温（4℃）储存 。
　　该溶液每毫升含0.1mg核黄素。
    4.8.2 核黄素贮备液Ⅱ：取核黄素贮备液Ⅰ（4.8.1）10mL用0.02mol／L乙酸溶液稀释至100mL，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，低温（4℃）储存 。
　　该溶液每毫升中含10μg核黄素。
    4.8.3 核黄素标准工作液：取核黄素贮备液Ⅱ（4.8. 2） 10mL，用水稀释至 100mL。现用现配。
　　该溶液每毫升中含1μg核黄素。
    4.9 荧光素标准溶液
    4.9.1 荧光素贮备液：称取荧光素（Q／HG 22─786）0.0500g，用水稀释至1000mL，盛于棕色瓶中，低温（4℃）储存 。
　　该溶液每毫升中含50μg荧光素。
    4.9.2 荧光素标准工作液：取荧光素贮备液（4.9.1）1mL，用水定容至1000mL，盛入棕色瓶中，低温储存 。
　　该溶液每毫升中含0.05μg荧光素。
    4.10 溴钾酚绿pH指示剂：取溴钾酚绿（HGB 3386）0.1g，加氢氧化钠溶液（0.05mol／L）2.8mL使之溶解，再加水稀释至200mL。变色范畴ph4.6～5.2。
    4.11 连二亚硫酸钠（Na2S2O4）（Q／HG 2─001），防止吸潮。

    5 仪器、设备

    5.1 荧光分光光度计。
    5.2 估量 天平：感量0.0001g。
    5.3 电热恒温水浴。
    5.4 具塞玻璃刻度试管，15mL。

    6 试样的制备

　　摘 集具有代表性的样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，通过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温储存 备用。

    7 估量 步骤

    7.1 称样：单一饲料、配合饲料、浓缩饲料称取1～2g，精确至0.001g。维生素预混料称取0.25～0.50g，精确至0.0001g，将试样置于100mL容量瓶中。
    7.2 样液的制备：向盛样品的容量瓶中加65mL盐酸溶液（4.1），于沸水浴中加热30min，开始加热5～10min经常 摇动容量瓶，以防样品结块。或于121～123℃15 磅高压釜中加热30min。冷却至室温后，用氢氧化钠溶液（4.3）调剂 pH至6.0～6.5，然后马上加稀盐酸溶液（4.2）使pH值约为4.5（溴甲酚绿指示剂变为草绿色）。用水稀释至刻度。
　　通过中速无灰滤纸过滤，弃去最初5～10mL溶液，收集滤液于100mL 锥形瓶中。取整份清液，滴加稀盐酸检查蛋白质如有沉淀生成，连续 加氢氧化钠溶液，剧烈振摇，使之沉淀完全稀释来 测量体积。对高含量样品，取整分的澄清液，用水稀释至一定体积使含核黄素约为0.1μg／mL（以下操作避免紫外光照射）。
    7.3 杂质氧化：于a、b、c三支15mL刻度试管（5.4）中各吸入样液（7.2）10mL，同时做平行，向试管a、b、c中各加入1mL蒸馏水，向试管b中加入1mL核黄素工作液（4.8.3）。然后各加入冰乙酸（4.4）1mL，旋摇混匀后逐个加高锰酸钾溶液（4.6）0.5mL，旋摇混匀，静置2min，再逐个加入过氧化氢溶液（4.7）0.5mL旋摇，使高锰酸钾颜色在10s内消退。加盖摇动，使试管中的气体逸尽。
    7.4 测定：用荧光素溶液（4.9.2）调整荧光仪，使其平稳于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调整激发波长440nm，发射波长525nm，测定试管a、b的荥光强度，生猪价格，样液在仪器中受激发光照射不超过10s。在试管c中加入20mg连二亚硫酸钠，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定卒荧光强度作为空白。若溶液涌现浑浊，不能读数。

    8 估量 结果的运算 和表述

    8.1 运算 方法和公式

　　核黄素（维生素B2）含量以mg／kg（或g／kg）表示，按下式运算 ：

    核黄素（VB2mg／kg）＝〔（A－C）／（B－A）〕×（M／m）×（V／V1）×R

    式中：A──   试管a（样液加水）的荧光强度；
          B──   试管b（样液加标样）的荧光强度；
          z ──  试管c（样液加连二亚硫酸钠）的荧光强度；
          m──   加入核黄素标样的量，μg；
          V──   样液的初始体积，mL；
          V1──  测定时分取样液的体积，mL；
          m──   试样质量，g。
          R──   稀释倍数。
　　      A-C／B-A值应在0.66～1.5，否则需调整样液的浓度。
    8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。

    9 重复性

　　同一估量 者对同一试样同时或快速持续进行两次测定，所得结果之间的差值：
　　在核黄素含量小于或等于5.0mg／kg时，不得超过平均值的15％。
　　在核黄素含量大于5.0mg／kg时，不得超过平均值的10％。
　　在核黄素含量大于50mg／kg时不得超过平均值的5％。