摘要分别用PCR方法和酶联免疫吸附试验对摘 自莆田部分猪场的382份临床发病育肥猪扁桃体和465份种猪血清样品进行了检测，以估量 PCV2的感染情景。结果掩饰：发病育肥猪PCV2的阳性率为74．60％，种猪PCV2平均阳性率为20．61％。

关键词 猪圆环病毒Ⅱ型 PCR 酶联免疫吸附试验 感染

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒Ⅱ型(PorcineCireovirus，PCV2)引起猪的一种多系统功能障碍性疾病。研究掩饰，猪圆环病毒Ⅱ型不仅是断乳仔猪多系统衰竭综合症的病原，而且与猪皮炎及肾病综合征、猪增生性坏死性肺炎、猪唤 吸与繁育 障碍综合征、猪粗壮病毒病等有重要关联。随着莆田市生猪规模化养殖的连续发展，由PCV2引起的疫病呈上升方向，患猪主要表现为皮肤表面有红色斑点．皮肤惨白、黄疸，部分保育猪耳朵先水肿后干瘪．眼睑水肿，腹式唤 吸，消瘦，死淘率高，母猪繁育 障碍，产前、产后厌食等。分别用特异性PCR方法和酶联免疫吸附试验对摘 自莆田市各县区l7个规模化猪场的382份临床发病育肥猪扁桃体和465份种猪(其中公猪37头、母猪428头)血清进行了检测，较为详实地把握 PCV2在莆田市部分地方的流行动态．为科学防控该病提供参考。

1材料与方法

1．1样品382份临床发病育肥猪扁桃体和465份种猪血清样品摘 自莆田市各县区l7个规模化猪场．-40℃储存 备用。

1．2试剂DNA提取试剂盒DNAzol Reagent购自Invitrogen公司，DL2000 DNA Marker为大连宝生物公司生产；其他试剂均为国产估量 纯。PCV2型ELISA诊断试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限责任公司。

1．3 引物 参考文献设计引物，扩增片段为647bp，由上海英骏生物技术有限公司合成，用前稀释成20 pmol／L，-20℃储存 备用。Pl：5′-GGTI'ACACG．GATATrGTAGTCC一3′；P2：5′一CGTrACCGCAGAA—GAAGACAC一3′。

1．4 DNA提取 去除扁桃体表面的筋膜．称取50 mg剪碎；加入DNAzol充分研磨；将匀浆液转移至1．5 mL的离心管中，12 000 r／min离心lo min后，取上清至另一离心管中，加入50μL无水乙醇，混匀，室温放置5min，DNA可见析出．4000 r／min离心3min，弃上清，75％乙醇洗涤2次，空气中干燥10s，缓慢加入100 txL 8 mmol／L NaOH溶解DNA一40℃储存 备用。

1．5 PCV2的检测PCR反应体系为：ddH2O4．8uL，上、下游引物各0．5uL，模板1uL，10×PCRbuffer luL，25 mM MgCl2 1uL，dNTP Mixtures lμL和Taq酶0．2μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，54 ℃退火50 S，72℃延伸50s，30循环，而后72℃延伸10 min。PCR反应完结后，l％琼脂糖凝胶电泳检测所得产物，在凝胶成像系统下察看结果、拍照．以涌现647bp特异条带的样品为阳性。

1．6 PCV2的ELISA检测

1．6．1洗涤液的稀释将浓缩的洗涤液放入37℃水作20倍稀释后备用。

1．6．2血清的稀释取96孔板，Al、Bl为阴性对照孔。Cl、Dl为阳性对照孔，其余作检测孔．每孔一个样品。在A1、Bl、Cl、Dl孔L中加入稀释液l80μL，其余孔加稀释液195恤L，然后分别在A1、Bl两孔加放阳性对照血清。在C1、Dl两孔L加放阴性对照血清，每孔各加60μL，其余每孔加待检血清5μL。

1．6．3操作步骤(1)取出检测板，用稀释好的洗涤液洗板2次(20μL孔)，每次静置2min后倒掉。在吸水纸上拍干。(2)取稀释好的待检样品10“L加入来 检测板中：阴性对照和阳性对照各设2孔．每孔10μL；轻轻振匀，于37℃温育30min。(3)甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μL孔，每次静置3 min后，倒掉，在吸水纸上拍干。(4)每孔加羊抗猪酶标二抗l0μL，置37℃温育30 min。(5)洗涤5次，养猪网，方法同上。每次在吸水纸上拍干。(6)每孔L先加底物液A 50μL、再加底物液8 50uL，混匀，室温避光显色lo min。(7)每孔L加终止液50μL，10 min内判定结果。(8)在酶标仪上测各孔0D630值。

1．6．4 结果判定 在阳性对照孔OD630值大于l．0，阴性对照孔0D630值小于0．2前提下，待测孔0D630脚值≥0．42，判为阳性；0D630值介于0．38与0．42之间为可疑；0D630值