中国自二十世纪七十年代初期开始研究使用液氮对精液进行冷冻保存，九十年代，中国将颗粒冻精技术逐步发展为细管冻精技术，该技术在奶牛发情配种方向已经全面实现，在反刍动物、稀有动物以及特种经济动物繁育中发挥了极大的作用。然而，该技术在猪的养殖、改良等方面发展相对匮乏，需要进一步的研究和发展来推动其广泛应用。
冷冻保存猪精液的最大优势在于能够显著延长精液的使用期限，通过将其置于液氮中进行冷冻保存，理论上可以实现无限期的保存。这一方法不仅具有长期保存的精液资源价值，还能有效降低饲养管理成本与引种成本。以2022年为例，全年可繁育母猪数量达到4 400万头，若全部采用自然交配（本交）的方式，将需要大约150万头种公猪。然而，若采用冷冻保存的精液进行人工授精，则仅需大约3万头种公猪，这意味着冷冻保存精液所需种公猪的数量仅为自然交配方式的2%。由此可见，使用冷冻精液能够极大地降低种公猪的养殖成本，进而提升经济效益。此外，优质种公猪的冷冻保存精液还具备长距离运输的便利性，不受地域与时间的限制。这一特性打破了优质种猪的地域性局限，使得优良基因能够更广泛地传播，对促进生产性能提升与品种改良具有积极作用。
1猪精液保存方式
1.1常温保存
常温保存是一种常用于短时间储存及近距离运输猪精液的方法。该方法需要将采集到的猪精液添加适量的稀释液，并加入CO2或酸性物质以创造弱酸环境。弱酸环境能够降低精子活力，从而减少精子的能量消耗，达到延长保存时间的目的。当需要使用时，只需将稀释液中的pH恢复到适宜水平，精子便可从静止状态恢复为活跃状态，受精能力也恢复。该方法可以将精子于15～25℃下短期保存1～5 d。
1.2低温保存
低温保存适用于长距离运输。将精液采集之后，使用稀释液以及酸性物质稀释精液，隔绝空气，并添加适量的营养物质，置于0～5℃的低温环境保存。低温可以有效抑制精子代谢、活力以及细胞内酶活性，是生产实践中常用的保存方法。该方法相对于常温保存，可以更好的降低ATP的释放以及活性氧的产生，添加的营养物质以及抗低温物质，可有效延长精子存活时间。
1.3冷冻保存
冷冻保存时间长，可用于种质资源跨国际保护及交流。冷却源为液氮或干冰，使用甘油、二甲基亚砜等抗冻剂作为冷冻稀释液，精子经冷冻处理之后，细胞内外渗透压不同，水分子通过细胞膜流出细胞外，可以达到精子脱水以及冻结成固态的目的。
2冷冻保存特点及原理
公猪精子对环境温度极为敏感。在采集精液后，若将其迅速冷却至15℃、5℃或甚至0℃，这一系列急剧的温度变化会导致精子活力显著降低，伴随顶体损伤以及细胞膜通透性的下降，从而使得精子容易失去其原有的活力。猪精液冷冻保存需要缓慢降低精子周围环境温度，最后置于超低温环境，精子代谢速率基本会完全停止。干冰的价格要高于液氮，因此，液氮作为超低温冷却源应用更加广泛。在降温的过程中，精子细胞内会产生冰晶，损伤细胞膜与细胞内部细胞器，这是由于在冷冻过程中细胞内外冰晶的形成速率不同，细胞内冰晶形成速率要大于细胞外，细胞内形成的较大冰晶会损伤细胞，当细胞内冰晶呈微晶状态，可以最大限度减少冰晶对精子细胞的损伤。细胞外冰晶形成的过程中，渗透压升高，若细胞内水分子大量排出，使精子细胞处于失水状态，会导致精子失水过多死亡。周围环境的迅速改变，还会导致精子细胞氧化应激，产生大量活性氧，精子细胞膜会因为不饱和脂肪酸发生了氧化反应而破损，造成精子细胞因为细胞结构的完整性被破坏而死亡。因此，公猪精子冷冻保存主要通过抑制冰晶形成以及预防氧化应激这两个方面实现。
3冷冻保存对猪精液的影响
3.1受精能力下降
在崔艳颖等的研究中，保存了13年的精子活力下降了40%，顶体完整性下降了12%。对体外受精能力的检测中，保存时间最长的一批冷冻精液卵裂率只有52%，囊胚率仅为16.3%，且DNA损伤最严重，在该研究中发现，冷冻保存的精子13年后的直线运动性显著下降，严重影响受精能力。损伤最大的是受精能力以及DNA的完整性，冷冻保存会影响精液DNA损伤以及线粒体膜通透性。
3.2抗氧化能力降低
在黄清松的研究中，冷冻保存影响公猪精子的抗氧化能力，冷冻保存的精液总抗氧化能力与新鲜精子水平相比，下降极其显著，谷胱甘肽过氧化物酶活性下降，超氧化物歧化酶活性显著下降，精子内有毒物质丙二醛含量显著上升，活性氧水平显著上升。
3.3超微结构发生变化
恢复后的精液与新鲜精液相比，出现了精子顶体破裂现象，部分精子甚至顶体完全裂解，顶体内顶体酶流出细胞外，精子头部质膜也有破损和裂解的现象，精子尾部与头部连接处破损严重，部分精子颈部断裂，头尾分离，精子尾部的线粒体结构排列模糊，外膜破损，部分精子可以观察到整体发生裂解。
4优化冷冻保存建议
4.1稀释液
公猪精子收集后可将其置于4℃冰箱进行温度平衡，平衡时间一般不超过2 h。再加入稀释剂对精液进行稀释，稀释剂一般为蛋白质、脂类、糖类、缓冲剂、冷冻保护剂等添加剂的混合物。
4.2冷冻保护剂
常用的有机冷冻保护剂有二甲基亚砜、甘油和丙二醇等，由于该类物质的特性，可以有效降低细胞内溶液的冰点，减少细胞内冰晶形成。无机冷冻保护剂有蔗糖和氯化钠，这类物质溶于水之后，平衡细胞外水分差异，有助于防止细胞脱水。在之前的研究中，冷却剂中可以添加100μmoL/L锰苯甲酸卟啉，公猪精子冷冻后的动力学参数与形态得到改善。
4.3抗氧化剂
常用酶促抗氧化剂有谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶以及过氧化氢酶。在工作实践中也会使用维生素E、维生素C、低牛磺酸、硒、谷胱甘肽以及褪黑素作为自由基清除剂。
4.4抗菌物质
现阶段对猪使用采精系统进行采精程序的养殖形式并不多见，整个过程多为人工采集。消毒、卫生条件不达标，有可能使精子在采精过程中被污染，同样，处理与保存过程中也有被污染的可能。微生物会与精子细胞争夺营养以及损伤精子细胞，造成精子质量下降并使精子寿命缩短。被污染的精液通过人工受精的方式输入母猪的子宫，很有可能导致发生子宫内膜炎等疾病。因此，在冷冻保存之前，稀释液中可添加一定量的抗菌物质。如在稀释液中添加0.02 g/L的磺胺，可以有效抑制葡萄球菌和假单胞菌；0.4 mg/mL的互叶白千层和迷迭香精油，产生的效果与氨苄青霉素类似；抗菌肽PMAP-37也能有效抑制精液中细菌数量同时可以保持精子活力。
4.5调节降温程序
精液采集前，需要将采精杯、滤纸保鲜袋等置于恒温箱中预热至37℃，精液收集后立即送往实验室，取一滴精液于显微镜下观察，确定精子活力正常且无畸形等异常情况，再进行降温处理。使用毛巾包裹收集瓶室温静置1 h，使其缓慢下降至17℃，有助于降低抗低温打击，该过程结束后进入离心浓缩稀释程序，添加17℃蛋黄冷冻稀释液，17℃条件下800 g离心10～25 min，离心前，可在离心瓶瓶底加入1～2 mL离心垫，防止精子沉淀以及紧贴底部导致精子损伤。之后采用水浴降温至15℃，再缓慢降温至4℃，人工操作可能使温度保持不均衡，建议使用降温平衡柜来达到精准控制降温速率。4℃降温程序结束，可进行冷冻降温环节，精液添加稀释剂后，可在4℃条件下进行灌装，提前打开冷冻仪并执行程序，完成灌装后记录冷冻料架，迅速转移至冷冻仪中降温。
5小结
影响公猪精子的因素有很多，严格控制采精场地的卫生、消毒程序，可以减少精液中细菌含量。自动采精系统相较于传统人工采精，精液中细菌含量可以最大程度得到控制。季节、个体健康以及公猪年龄等因素，会影响精液品质。精液采集时选取第二段富含精子的精液，并对精子健康状况与活力进行检查，避免出现劣质、死亡、凋亡的精子，之后进行精子耐冻性试验，只有符合条件的精子才能进行冷冻保存。冷冻保存技术的发展，可以对优秀的种猪资源进行利用，同时，冷冻保存可以克服距离的问题，实现了种猪资源的交流，减少了养殖户运输成本的同时又极大丰富了猪只的类型。现阶段，猪精液冷冻保存技术虽在逐步发展，冷冻之后的精子质量、活性以及受精率等问题，还需要在之后的研究与实践中实现进一步的发展。
