猪流行性感冒（swine influenza，SI）简称猪流感，是由猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的一种急性、接触性传染的猪呼吸道疾病。仔猪感染SIV的发病率高，感染猪群短时间内可相继发病，主要出现发热、食欲不振、打喷嚏、严重时出现呼吸困难等呼吸道症状。猪单独感染SIV的死亡率比较低，发病期间若混合感染其他病原会导致死亡率骤增，进而对养猪业造成较大的经济损失。目前，世界范围内已报道过多种亚型SIV在猪群中流行，包括H1N1、H1N2、H3N2、H5N1、H7N7及H9N2等亚型，其中H1N1、H1N2、H3N2为主要流行亚型。猪的呼吸道上皮细胞内同时具有SAa-2,3 Gal和SAa-2,6 Gal受体，使其成为禽流感病毒、猪流感病毒、人流感病毒的共同易感宿主，并成为不同亚型流感病毒基因重组、基因变异以及跨种属传播的天然“混合器”。如果猪流感出现地区流行或大流行，可能会对人类造成威胁，因此对猪流感病毒的流行情况进行持续监测具有重要意义。本研究从云南省昆明市一规模化养猪场疑似SI病猪的鼻拭子样品中成功分离到1株H3N2亚型SIV，对分离株进行全基因测序和遗传进化特征分析，并评价了该毒株对仔猪的致病性，为监测SIV在我国的流行情况以及SI疫苗的研制提供支持和参考。

　　1材料与方法

　　1.1病料、鸡胚与细胞株

　　2023年6月从云南省昆明市一规模化养猪场采集疑似SI病猪的鼻拭子，置于5ml拭子液（含100万IU/L青霉素G钠和1000 mg/L硫酸链霉素的DMEM）中，冷藏运至实验室后置-70℃以下保存。SPF鸡胚购自济南赛斯家禽科技有限公司，孵化至9～11日龄后使用。犬肾上皮细胞系（MDCK），由华威特（江苏）生物制药有限公司冻存、提供。

　　1.2主要试剂

　　DNA/RNA提取试剂盒（批号：017E2211GA），购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；一步法RT-PCR试剂盒（24122），购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司；SIV荧光PCR试剂盒（2023001），购自湖南冠牧生物科技有限公司；SIV H1亚型、H3亚型特异性阳性血清，由华威特（江苏）生物制药有限公司制备提供；0.5％鸡红细胞悬液，由本实验室现用现制。

　　1.3实验动物

　　10～12周龄健康仔猪购自江苏省泰州市一养猪场，经RT-PCR检测为SIV抗原阴性，经血凝抑制试验（HI）检测为SIV抗体＜1:10。

　　1.4引物合成

　　参照《GB/T 27521—2011猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法》合成SIV分型引物（表1），引物由南京金斯瑞生物科技有限责任公司合成。

　　1.5样品检测与病毒分离

　　从-70℃取出冻存的鼻拭子样品置室温融化，充分振荡后抽取液体转移至其他离心管，取200μL液体提取核酸后采用SIV荧光PCR试剂盒进行检测。检测为SIV核酸阳性后，将剩余液体以4000 r/min在4℃离心10 min，吸取上清用0.45μm滤膜过滤除菌后接种9～11日龄SPF鸡胚，0.2 ml/胚。鸡胚置37.0～38.0℃，湿度50%～60%条件下培养72 h，置4℃过夜后，无菌条件下收集24～72 h内死亡和存活鸡胚的尿囊液，分装后置-70℃以下保存。按常规微量血凝试验法，测定尿囊液的红细胞凝集价（HA）。当HA≥1∶8时可做进一步扩大培养并鉴定；若HA＜1∶8，可将尿囊液盲传2代，HA仍＜1:8时可终止试验。

　　1.6病毒的鉴定与命名

　　按照路伟采用的细胞病毒培养方法，将具有血凝价≥1∶8的尿囊液接种MDCK细胞扩大培养。采用朱向蕾的血凝抑制试验方法，将病毒液与SIV H1亚型、H3亚型特异性阳性血清进行红细胞凝集抑制试验，进行血清学鉴定。按照国标中的方法对收获的病毒液进行SI分型RT-PCR鉴定；将鉴定后的病毒液经超滤、层析等步骤纯化，送扬州大学测试中心进行电镜观察并照相。按照WHO公布的流感病毒通用命名系统进行命名。

　　1.7全基因测序

　　按照DNA/RNA提取试剂盒提取病毒液的RNA，核酸浓度检测合格后采用二代测序技术进行全基因组测序，测序由上海探普生物科技有限公司完成。

　　1.8遗传进化和分子特征分析

　　将病毒8个节段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS）的测序结果，提交NCBI进行在线BLAST比对，鉴定病毒亚型并对核苷酸同源性进行分析。用MEGA7.0中的邻接法（Bootstrap值设为1000），将病毒全基因序列与GenBank数据库中收录的参考毒株基因序列进行系统进化分析。利用在线软件（

　　https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/）预测HA和NA蛋白的潜在糖基化位点。利用MegAlign软件分析SIV H3N2 KM株的HA蛋白关键受体位点的氨基酸变异情况。

　　1.9对仔猪致病性试验

　　筛选10～12周龄健康易感猪（SIV抗原阴性、HI抗体＜1∶10）7头，随机选取5头，经气管注射SIV H3N2 KM株病毒液（104.7 TCID50/mL），4.0 mL/头；剩余2头经气管注射无菌PBS，4.0 mL/头，相同条件下隔离饲养作为阴性对照。攻毒后1～5d，每日定时测温、观察临床症状；攻毒后3～5d，采集鼻拭子样品接种9～11日龄SPF鸡胚培养，鸡胚尿囊液HA≥1∶8时，判为鼻拭子病毒阳性，反之为阴性；攻毒后5d，剖检观察肺部病变，采用28分制评分法评估病变严重程度，取肺脏病变组织进行免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测（委托武汉赛维尔生物科技有限公司完成）。

　　2结果

　　2.1病毒的分离及鉴定

　　经RT-qPCR检测，采集的17份鼻拭子样品中2份为H3亚型SIV阳性。接种鸡胚并盲传后，1份样品的鸡胚尿囊液HA为1∶32。经MDCK细胞扩大培养后，病毒收获物的HA为1∶128，病毒含量为104.7 TCID50/ml。特异性阳性血清鉴定分离病毒为H3亚型SIV，分型引物鉴定分离病毒为H3N2亚型SIV（图1）；透射电镜下可见直径100±20 nm的球形或椭圆形的病毒粒子，具有囊膜，且囊膜表面有许多放射状排列的突起（图2）。根据命名通则，将该分离病毒株命名为A/Swine/YunNan/KM/06/2023（H3N2），简称SIV H3N2 KM株。

　　注：M.Trans 2000 Maker；1.H3亚型鉴定；2.阴性对照；3.N2亚型鉴定；4.阴性对照。

　　图1分离病毒的SIV分型引物鉴定结果

　　图2分离病毒的电镜图片

　　2.2病毒全基因组的同源性比对

　　采用二代测序技术对分离病毒的全基因组测序，测序结果经BLAST比对显示，SIV H3N2 KM株的8个基因节段分别与不同年份、不同地区的8个流感病毒株相对应基因节段的同源性最高，其中HA、NA基因与H3N2亚型SIV同源性最高，PB2、PB1、PA、NS基因与H1N1亚型SIV同源性最高，NP基因与H1N1亚型人流感病毒的同源性最高，M基因与H1N2亚型SIV同源性最高（表2）。同源性比对结果表明，SIV H3N2 KM株发生了不同流感病毒之间的重组，该毒株由不同种属、不同亚型的流感病毒重组而成。

　　2.3全基因组的遗传进化分析

　　遗传进化树结果显示，SIV H3N2 KM株的HA、NA基因与来自山东的类人H3N2流感谱系（human like H3N2）的A/swine/Shandong/15/2018（H3N2）株的亲缘性最高，遗传进化均处于同一分支（图3a、b），提示2个基因节段可能来源于山东地区的SI，表明我国的SIV可能存在跨地区远距离传播的现象。内部基因PB2、PB1、PA、NP和M均来源于2009年大流行H1N1谱系（pdm/09 H1N1），NS基因来源于古典型H1N1谱系（CS H1N1）（图3c~h）。

　　图3 SIV H3N2 KM毒株的（a）HA、（b）NA、（c）PB2、（d）PB1、（e）PA、（f）NP、（g）M、（h）NS基因的分析遗传进化树

　　2.4 HA与NA蛋白分子特征分析

　　根据HA与NA基因核苷酸序列推导出的氨基酸序列，与参考毒株A/New York/55/2004（H3N2）相应蛋白的氨基酸序列的相似性分别为91.45％、93.18％。HA蛋白切割位点的氨基酸序列为PEKQT↓R，不具备连续的碱性氨基酸，符合低致病性流感病毒的分析特征。HA蛋白的关键受体位点未发生改变（190D、223V、226I、228S），表明其能够结合人流感病毒SAa-2,6-Gal受体。在线软件预测HA蛋白有7个潜在的糖基化位点，NA蛋白有4个潜在的糖基化位点（表3）。

　　2.5对仔猪致病性试验

　　感染组动物攻毒后2～5d出现体温升高（图4）、打喷嚏、流鼻涕等一项或多项症状，攻毒后3～5d感染组仔猪鼻拭子的鸡胚培养物HA均不低于1∶16，表明感染SIV H3N2 KM株的仔猪可通过鼻腔向环境中排毒。攻毒后5d剖检，感染组4头仔猪的肺脏出现斑块状肉样实变（图5），病变评分最高为11分。IHC结果显示，仔猪感染SIV H3N2 KM株后，病毒可在仔猪肺脏中大量复制增殖（图6）。试验期间，对照组仔猪未观察到异常症状，剖检肺脏未出现病变。研究结果表明，SIV H3N2 KM株对仔猪具有较强的致病力。

　　3讨论

　　SIV在1930年被分离鉴定后，就一直在不断发生变异、重组，猪群中最初感染的H3N2亚型流感病毒是人源H3N2亚型流感病毒。意大利学者研究发现，20世纪70-80年代分离到的H3N2亚型SIV的8个基因节段均与人流感病毒相似，之后开始与猪群中流行的类禽H1N1亚型SIV（EA like H1N1 SIV）中的6个内部基因节段发生重组。2009年甲型H1N1流感在全球范围内大规模流行，之后美国猪群中检测到1种H3N2变异毒株，包含了来自禽流感、人流感和猪流感病毒的基因片段，且含有pdm/09 H1N1毒株的M基因，并于2011年从人群中监测到了该病毒。BOWMAND等研究表明，H3N2亚型SIV获得pdm/09 H1N1的M基因后可使其更加容易感染人。Lu等在2019年报道了从1个10岁女童的鼻咽拭子中检测到“三源重组H3N2亚型SIV”，其内部基因包含了pdm/09 H1N1的PB2、PB1、PA和NP基因，表面基因HA和NA来源HL-H3N2谱系。遗传进化分析显示，本研究分离到SIV H3N2 KM株的HA与NA基因节段来源于HL-H3N2谱系，PB2、PB1、PA、NP和M基因来源于pdm/09 H1N1谱系，NS基因来源于CS H1N1谱系，表明该病毒是三源重组H3N2亚型SIV，且由于该毒株获得了pdm/09 H1N1谱系的M基因，其感染人的能力有可能出现增强。

　　流感病毒的受体宿主范围与病毒表面HA蛋白受体结合位点的氨基酸有着紧密联系，对于H3亚型流感病毒，其HA蛋白的226位和228位氨基酸对影响受体与宿主细胞结合方面起着关键作用，早期人源H3N2亚型流感病毒在226位和228位的氨基酸为L、S，近期人源H3N2亚型流感病毒在这两个位点的氨基酸为I、S。分子特异性分析显示，SIV H3N2 KM株HA蛋白的190位氨基酸为D，226位氨基酸为I，228位氨基酸为S，表明该病毒具有结合人流感病毒受体SA-a-2,6-Gal的能力。流感病毒表面蛋白糖基化位点的变化，有可能会对病毒的抗原性与病毒对宿主细胞的识别产生影响，由此可引起病毒的生物特性产生变化，从而可使病毒逃避宿主免疫。糖基化位点预测结果显示，SIV H3N2 KM株的HA蛋白有7个潜在的糖基化位点，比人流感病毒A/New York/392/2004（H3N2）减少了4个位点（8NSTA、133NGTS、144NNSF、165NVTM），比A/swine/Guangxi/978/2017（H3N2）增加了1个位点（38NATE），与

　　A/swine/Heilongjiang/684/2017(H3N2)的糖基化位点数相同。

　　方超等从疑似SI发病猪的鼻拭子中分离到1株H3N2亚型SIV，动物回归试验显示对仔猪具有致病性。本研究分离的SIV H3N2 KM株病毒回归动物后，仔猪也出现了发热、打喷嚏、流鼻涕等流感症状，感染猪的鼻拭子可检测到排毒，剖检后肺脏出现实变，IHC显示病毒在肺脏中大量复制增殖。参考路伟建立的SI发病标准，SIV H3N2 KM株感染仔猪后的发病率为5/5，表明该毒株具有较强的致病力。目前，没有直接证据表明SIV病毒具有在人与人之间传播的能力，但近年来人类感染SIV的报道越来越多，因此无论从公共卫生安全还是从保障养猪业健康发展的角度考虑，均应加强猪群中SIV流行情况的监测及致病性研究，降低SI对养猪业造成的损失及由其引发的潜在公共卫生安全。

　　综上，本研究分离到的1株H3N2亚型SIV并命名为A/swine/YunNan/KM/06/2023（H3N2），其基因片段来源于H3N2亚型谱系、pdm/09 H1N1谱系、CS H1N1谱系，对仔猪具有较强的致病性。研究结果为我国SIV流行情况的监测以及H3N2亚型SIV的遗传演化研究提供了参考，也为研制H3N2亚型SI疫苗提供了候选毒株。