中国农业科学院哈尔滨兽医研究所翁长江研究员团队于2024年3月在Journal of Virology上发表了一篇题为“African swine fever virus pH240R enhances viral replication via inhibition of the type I IFN signaling pathway”（非洲猪瘟病毒pH240R通过抑制I型干扰素信号通路来增强病毒复制）的文章。
研究结果显示，ASFV pH240R通过抑制I型干扰素信号通路来增强ASFV的复制，这为开发ASFV减毒活疫苗提供了线索。
研究影响ASFV毒力和复制的重要蛋白是开发有效疫苗和药物的关键
IFN是一种重要的抗病毒细胞因子，可在病毒感染过程中诱导产生干扰素刺激基因(ISGs)，发挥间接抗病毒作用。已有研究表明，ASFV pH240R是一种衣壳蛋白，它参与ASFV的组装。与亲本ASFV HLJ/18相比，含H240R基因缺失的重组ASFV(ASFV-ΔH240R)在猪肺泡巨噬细胞(PAM)中诱导炎性细胞因子的表达水平高于亲本ASFV。作者先前的研究表明，pH240R通过靶向STING抑制cGAS-STING信号通路来抑制I型干扰素的产生。值得注意的是，ASFVΔH240R对IFN-α的敏感性高于亲本ASFV HLJ/18，目前尚不完全清楚其作用机制。
在本研究中，作者发现ASFV pH240R通过抑制I型干扰素信号通路，抑制了IFN-α诱导的ISRE的激活和ISGs的表达。在机制上，pH240R通过与IFNAR1和IFNAR2相互作用，显著干扰了IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用。此外，与亲本ASFV HLJ/18相比，ASFV-∆H240R感染诱导了更多的ISGs。作者还证实，pH240R通过抑制IFN-JAK-STAT信号通路而促进ASFV的复制。这些研究结果显示，pH240R通过抑制I型干扰素信号通路来增强ASFV的复制，这为开发ASFV减毒活疫苗提供了线索。
研究结果
结果一：pH240R通过抑制I型干扰素信号通路增强ASFV复制
作者之前的研究表明，与其亲本ASFV HLJ/18相比，IFN-α更显著地抑制ASFV-ΔH240R的复制。为检测I型干扰素信号通路对ASFV-ΔH240R复制的影响，用抗IFNAR1或抗IFNAR2抗体阻断猪肺泡巨噬细胞（PAM），随后用IFN-α处理，再用野生型ASFV(ASFV-WT)或H240R缺陷型ASFV（ASFV-ΔH240R）感染。结果表明，IFN-α对ASFV-∆H240R的抑制作用强于其亲本ASFV HLJ/18，而阻断IFNAR1和IFNAR2则挽救了IFN-α对ASFV-HLJ/18和ASFV-ΔH240R复制的抑制作用，表明IFN-α激活的I型干扰素信号通路是抑制ASFV复制所必需的(图1A)。为了证实这一结论，猪肺泡巨噬细胞（PAMs）进行加或不加TYK2抑制剂的处理。结果表明，与其亲本ASFV HLJ/18相比，TYK2抑制剂促进了ASFV-ΔH240R在猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中的复制，并减弱了IFN-α对ASFV-ΔH240R复制的抑制作用(图1B)。
为了探讨IFANR2及I型IFN信号通路对ASFV复制的影响，用针对IFANR2基因的小干扰RNA（siRNA）感染PAM细胞，然后以相同基因组拷贝数108感染ASFV-WT或ASFV-ΔH240R 24 h。结果表明，感染ASFV-WT或ASFV-ΔH240R的PAM中，携带siIFNAR2诱导的Isg56的mRNA水平降低，ASFV-ΔH240R诱导的Isg56的mRNA转录水平比ASFV HLJ/18高(图1C)。作者还发现，下调IFNAR2的表达增加了ASFV-WT和ASFV-ΔH240R的病毒滴度，并且ASFV-ΔH240R的病毒滴度低于ASFV-WT(图1D)。综上所述，结果表明ASFV pH240R是ASFV复制所必需的，它通过抑制I型干扰素信号通路而增强ASFV复制。
图1 ASFV pH240R通过抑制I型IFN信号通路增强ASFV复制
结果二：ASFV pH240R抑制ISGs的产生
为了评估ASFV pH240R对ISGs产生的潜在作用，将剂量递增表达pH240R的质粒分别与ISRE、ISG54和ISG56中的一种报告基因，与Renilla-TK Luc共转染HEK293T细胞24 h，随后用IFN-α处理6 h，收集细胞进行荧光素酶活性检测。结果显示，pH240R以剂量依赖的方式抑制ISRE、ISG54和ISG56的启动子活性（图2A-C）。通过定量聚合酶链式反应(qPCR)检测mRNA表达水平，结果显示，pH240R以剂量依赖的方式抑制ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达(图2D-F)。综上所述，研究结果表明，pH240R抑制I型干扰素信号通路。
图2 ASFV编码的pH240R抑制I型干扰素信号通路
结果三：ASFV-ΔH240R比ASFV-WT诱导更多的ISG
为进一步检测H240R基因在ASFV感染时对ISGs合成的影响，用拷贝数为108的ASFV-ΔH240R或其亲本ASFV-WT感染PAM细胞12h，随后用IFN-α处理细胞12h。收集细胞，用定量聚合酶链式反应(qPCR)检测ISGs的mRNA表达水平。结果显示，与ASFV-ΔH240R相比，ASFV-WT感染显著抑制了IFN-α诱导的ISGs的基因表达水平（图3A-D）。作者注意到虽然ASFV-WT和ASFV-ΔH240R的基因组DNA拷贝数没有差异，但ASFV-ΔH240R的基因组DNA拷贝数显著低于ASFV-WT(图3E)，排除了ASFV-ΔH240R对ISGs的影响是由于更多的病毒颗粒而不是H240R基因功能丧失所致。
图3 ASFV-ΔH240R比ASFV-WT诱导更多的ISG
结果四：ASFV pH240R通过与IFNAR1和IFNAR2相互作用来干扰IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用
为了进一步阐明pH240R抑制I型IFN信号通路的靶点，作者首先检测了pH240R是否通过直接靶向ISGF3来抑制ISGs的转录。将表达pH240R和ISGF3组分的质粒分别与ISRE报告基因和Renilla-TK Luc转染HEK293T细胞。结果表明，pH240R不能抑制ISGF3介导的ISRE报告基因的激活(图4A)，揭示pH240R负调控ISGF3上游的I型干扰素信号通路。作者为进一步探索pH240R在I型干扰素信号通路中的靶分子，将表达pH240R的质粒与表达IFNAR1、IFNAR2的质粒分别转染HEK293T细胞，进行免疫共沉淀（Co-IP）检测。结果表明，pH240R与IFNAR1和IFNAR2免疫沉淀（图4B）。随后用ASFV-WT感染PAM 24 h后，用抗IFNAR1/IFNAR2抗体进行Co-IP，在感染ASFV的PAM中验证了内源性IFNAR1/2和ASFV编码的pH240R的相互作用(图4C)。此外，作者还证实了在CRL-2843细胞中，pH240R与IFNAR1和IFNAR2共定位(图4 D、E)。
图4 ASFV pH240R与IFNAR1和IFNAR2相互作用
I型干扰素与IFNAR1和IFNAR2结合，分别募集TYK2和JAK1来触发级联信号。为了检测ASFV pH240R是否干扰IFNAR1-TYK2或IFNAR2-JAK1的相互作用，将HA-IFNAR1/HA-IFNAR2、Flag-pH240R和Flag-TYK2/JAK1单独或共同转染HEK293T细胞进行Co-IP（图5A、B）。将FLAG-pH240R表达载体转染HEK293T细胞24 h，加入IFN-α处理细胞6 h，再用抗IFNAR1抗体(图5C)或抗IFNAR2抗体(图5D)进行Co-IP。结果表示，过表达的pH240R显著降低了外源IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1之间的相互作用，以及内源IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1之间的相互作用。已有研究报道在募集TYK2和JAK1后，IFNAR1/2被磷酸化，随后TYK2和JAK1被自动磷酸化。作者还发现，当pH240R过表达时，IFNAR1、TYK2和JAK1的酪氨酸磷酸化水平显著降低。综上所述，结果表明，pH240R通过与IFNAR1和IFNAR2相互作用来抑制IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用，并降低IFNAR1、JAK1和TYK2的磷酸化水平(图5E、F)。
图5 ASFV pH240R干扰IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用
结果五：ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的磷酸化
STAT1和STAT2的磷酸化是I型干扰素信号通路下游的关键因子。为了确定ASFV pH240R是否抑制了IFN-α诱导的STAT1和STAT2的磷酸化，将表达pH240R的质粒转染HEK293T细胞24 h，加IFN-α处理细胞6 h，结果表明ASFV pH240R显著抑制了IFN-α诱导的STAT1和STAT2的磷酸化(图6 A、B)。为进一步检测H240R基因缺失是否影响STAT1和STAT2的磷酸化，用ASFV-WT或ASFV-∆H240R感染PAM，然后用IFN-α处理。作者发现ASFV-WT感染显著抑制了IFN-α诱导的STAT1和STAT2的磷酸化水平，而ASFV-ΔH240R感染减轻了ASFV-WT对STAT1和STAT2磷酸化的抑制(图6 C、D)。综上所述，结果表明，ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的磷酸化。
图6 ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的磷酸化
结果六：ASFV pH240R抑制ISGF3的三聚体形成
磷酸化的STAT1和STAT2形成异二聚体，其募集IRF9而形成异三聚体复合体ISGF3。作者为了探索ASFV pH240R在ISGF3复合体形成中的作用，将表达量不同的pH240R质粒转染HEK293T细胞24 h，随后加入IFN-α处理6 h。结果表明，pH240R显著抑制IRF9-STAT1和IRF9-STAT2的相互作用（图7A、B）。作者还发现，与其亲本ASFV HLJ/18相比，ASFV-ΔH240R感染PAM促进了内源IRF9-STAT1和IRF9-STAT2的相互作用(图7C、D)。综上所述，pH240R不与IRF9相互作用，但抑制了ISGF3的形成，从而中断IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用。
图7 ASFV pH240R抑制ISGF3的三聚体形成
结果七：ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的核内转移
作者为了确定ASFV pH240R是否能抑制IFN-α诱导的STAT1和STAT2的核内转移，将表达pH240R的质粒转染HEK293T细胞24 h，然后加入IFN-α处理6 h。结果表示，过表达pH240R抑制了STAT1和STAT2的核转位（图8A、B）。为进一步检测STAT1、STAT2和IRF9的核内转移是否受H240R基因缺失的影响，用ASFV-WT或ASFV-∆H240R感染PAM，随后加入IFN-α处理。作者发现，与其亲本ASFV HLJ/18相比，H240R基因缺失促进了STAT1、STAT2和IRF9的核内转移(图8C、D)。共聚焦结果表明，pH240R的过表达抑制了STAT1和STAT2的核内转移(图8 E-H)。综上所述，结果表明ASFV pH240R抑制了STAT1和STAT2的核内转移，从而抑制了ISGs的产生。
图8 ASFV pH240R抑制STAT1和STAT2的核内转移
本研究中，作者发现ASFV pH240R是干扰素信号通路的负调控因子，通过IFNAR1和IFNAR2相互作用来破坏IFNAR1-TYK2和IFNAR2-JAK1的相互作用，进而抑制ISGs的表达，从而抑制I型干扰素信号通路以增强ASFV的复制，揭示了pH240R作为潜在药物靶点的可能性，为开发ASFV减毒活疫苗和药物提供了线索。
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