本文将从实验室评估的角度，介绍酶制剂的特点、评估方法及主要的评估标准。希望能为大家在如何选择最适合的酶制剂时，提供一些参考信息。
文|周李娟郑和博士
建明研发部-客户实验室服务（CLS）
饲料中的三大营养物质为蛋白质、淀粉和脂肪，其中大豆和玉米分别为饲料中蛋白质和淀粉的主要来源。
据统计，中国饲料行业中，大豆及其副产品提供了60%的所需蛋白质[1]，玉米作为全世界产量最高的农作物，提供了85%以上的所需淀粉[2][3]。
由于疫情、天气以及俄乌战事影响，豆粕与玉米的价格自2022年1月以来一直居高不下。
在如此大的价格压力下，众多饲料企业纷纷采取营养效率最大化和成本控制的产品方案来提高豆粕、玉米等原料的营养效益。
酶制剂是一种具有生物活性的天然催化剂，其作为一种新型高效的饲料添加剂，为开辟新的饲料资源以及降低饲料生产成本提供了行之有效的途径。
不仅如此，酶制剂还可以同时提高动物生产性能和减少养殖排泄物的污染，为饲料工业和养殖业高效、节粮、环保等可持续发展目标提供了保障和可能性。
随着广泛的使用，酶制剂产品层出不穷，品质却参差不齐，给使用者在选择上带来很大的挑战。
01
酶制剂的定义
绝大多数酶制剂的化学本质是一类对其底物具有高度特异性和高度催化性的蛋白质。
酶的催化作用依赖于酶空间结构的完整，在高温、强酸、强碱等条件下，酶的空间结构会遭到破坏进而失去活性。
常见的饲用酶制剂从功能上主要分为两大类：
1 助营养消化酶，包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等；
2 去除抗营养因子的酶制剂，包括非淀粉多糖酶、黄曲霉毒素脱毒酶、植酸酶等。
02
什么是酶活力
酶活力是酶制剂最为重要的指标之一，活力越大表明酶制剂的催化反应效率越高。
以蛋白酶为例，酶活力在中国国家标准《GB/T 23527-2009蛋白酶制剂》中的定义为“1 g固体酶粉（或1 mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪蛋白产生1µg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g（U/mL）表示”。
由此可见，酶活力的大小由诸多因素决定，包括温度、pH值、酶添加量、底物成分和反应时间。
另外目前行业内缺少统一的强制性国标，因此不同生产厂家的酶制剂活力单位可能也存在偏差。
建明CLS推荐使用统一标准来评估不同的酶制剂，这对可靠有效的评估结果至关重要。
在2016至2021年间，建明CLS使用同样的评估标准（国标法）对42份不同蛋白酶产品的酶活力进行了分析评估（图1）。
图1.蛋白酶样品的总酶活力统计
我们发现，有35.7%的样品酶活力较高，大于100,000 U/g；31.0%的样品酶活介于10,000与50,000 U/g之间；21.4%的样品酶活介于1,000与10,000 U/g之间；其余两档酶活力的蛋白酶产品相对较少。
03
酶制剂的热、酸耐受率以及建明两步法评估
一个优质的酶制剂产品，拥有足够高的酶活力固然重要，但是其热耐受率以及酸耐受率同样不容忽视，上文提到的温度及pH值也是影响酶活力的重要因素。
酶制剂产品从制备到抵达动物肠胃道发挥作用需要经过若干个步骤，其中制粒过程中的高温条件（85℃）以及动物胃中的强酸环境（pH 2~3）均给酶活力带来了不小的挑战。
如果酶制剂产品无法耐受任何一个环节，其酶活力将大打折扣。
为了更客观地评估酶制剂在面对这种高温及强酸环境时的耐受性能，建明CLS采用体外两步法来模拟这两个环节。
如图2所示，我们采用与实际情况接近的实验条件来模拟高温制粒及胃强酸环境，通过测量这些环境条件对其酶活力所造成的影响来评估酶制剂产品的热耐受率和酸耐受率。
图2.两步法评估“有效酶活”
在这42份蛋白酶样品中，有三分之一的样品热耐受率低于50%，其中21.4%的样品耐温率低于10%，表示这部分样品无法耐受制粒过程中的高温处理，因此其酶活力严重受损。
动物体内蛋白质的水解作用主要发生在肠道内，肠液的pH在7.5至8.5之间，呈弱碱性。
蛋白酶可分为酸性、中性及碱性蛋白酶，鉴于肠道内的pH弱碱性环境，大部分蛋白酶产品都以中性或碱性蛋白酶为主，能否在通过胃酸后保持活性是这类蛋白酶的重要属性之一。
同样的42份蛋白酶样品，有61.9%的样品酸耐受率低于10%，只有11.9%的样品酸耐受率在75%以上。
这一结果显示，大部分蛋白酶样品的酸耐受性并不理想，会在过胃时丢失大部分的酶活力。
图3.蛋白酶样品的酸耐受率及酸耐受率统计
04
“有效酶活”的概念
包括蛋白酶在内，大部分的酶制剂都需要抵达动物肠道才能发挥其催化作用。
就算添加的酶活力再高，如果抵达肠道时所剩无几，那其功效也就可想而知。
为了能够更加简便客观地评估酶制剂，同时又考虑现实应用中高温及强酸环境所带来的影响，结合“两步法”，建明CLS在2020年提出了“有效酶活”的概念，旨在更加直观地评估一个产品的实际酶活力。
有效酶活的计算方法为：
有效酶活=酶活力×热耐受率×酸耐受率
使用有效酶活来评估酶制剂产品，能够充分考虑到各个影响酶制剂在靶点位置发挥催化作用的主要因素，更加客观地评估一份酶制剂的实际作用。
图4中的结果为同一批42份蛋白酶样品的有效酶活检测结果。
图4.蛋白酶样品的有效酶活统计
图中我们发现，76.2%的样品总酶活力在10000 U/g以上，然而最后只有4.8%的样品有效酶活仍在10000 U/g以上，95.2%样品的热耐受性或酸耐受性不理想，造成其实际酶活力大打折扣。
05
水解效率
由于酶制剂特殊的反应机制，其与底物发挥作用的前提是与底物充分结合，正如同一把钥匙开一把锁的原理。
不同底物与酶的结合亲和度将有所不同，这将影响酶反应的效率。
在实验室中常用的评估蛋白酶制剂酶活力的底物通常选用酪蛋白（19-24 kDa）[4][5]，这种蛋白质主要来源于乳制品，脯氨酸含量相对较高，而半胱氨酸含量较低，导致其具有较弱的二级结构且不能形成三级结构[6][7]。
然而在实际应用当中，大豆是动物饲料中蛋白质的主要来源，大豆球蛋白（11S）（300-360 kDa）是大豆蛋白的主要成分之一，其赖氨酸含量较高，蛋氨酸含量较低[8][9]。
相比酪蛋白，大豆球蛋白分子量更大，空间结构也更加复杂，与蛋白酶结合反应也有所差异[9]。
由以上信息不难看出，酪蛋白作为一种常规的蛋白酶酶活力分析底物，并不能完全替代以大豆球蛋白为代表的植物蛋白底物，仅以酶活力作为唯一评估标准显然不准确。
因此建明CLS实验室还对蛋白酶水解效果进行评估，使用豆粕作为底物，通过检测氨基酸释放率来评估蛋白酶的酶促反应效率。
如图5所示，42份蛋白酶对于豆粕蛋白底物的降解作用效果不尽相同。
其中，仅有5份样品的氨基酸释放提高率高于60%，有21份样品的氨基酸释放提高率极低，均小于10%。
如果您使用的日粮以其他谷物作为主要蛋白质来源，在选择最适合的蛋白酶制剂时，同样应该进行上述实验，找到最适合的蛋白酶产品。
图5.蛋白酶样品的氨基酸释放提高率统计
06
总结
随着饲料原料资源的短缺，原料价格一路高涨，酶制剂的使用能够提高饲料的利用率，用最小的成本起到最大的作用。
然而，由于酶制剂相对复杂的作用机理，如何正确地选择酶制剂是一个不小的问题。
以酶活力作为唯一标准的时代已经过去，一个好的酶制剂产品，不仅需要有足够的酶活力，其热耐受性及酸耐受性，以及针对特定底物的水解效果同样重要。
除了蛋白酶以外，日常畜禽生产中还会用到很多其他种类的酶制剂，例如淀粉酶、木聚糖酶、葡聚糖酶等。
这些酶制剂的评估方法与蛋白酶类似。
建明CLS希望通过这篇文章，让大家对于酶制剂的科学评估有更加深入的了解，助力实现增效降本。
Reference：
1.Sung W.K.,John F.L.,et al.Meeting Global Feed Protein Demand:Challenge,Opportunity and Strategy.Annual Review of Animal Biosciences.2019,7(17):1-23
2.S.A.Watson,Description,development,structure,and composition of the corn kernel,in:P.J.White,L.A.Johnson(Eds.),Corn:Chemistry and Technology,2nd ed.,American Association of Cereal Chemists Inc.,St.Paul,2003,pp.69–106.
3.A.K.Sinha,V.Kumar,H.S.P.Makkar,et al.,Non-starch polysaccharides and their role in fish nutrition-a review,Food Chem.127(2011)1409–1426.
4.Rafiee Tari N，Arranz E，Corredig M.Effect of protein composition of a model dairy matrix containing various levels of beta-casein on the structure and anti-inflammatory activity of in vitro digestates[J].Food Funct,2019,10(4):1870-1879.
5.Kibangou IB，Bouhallab S，Henry G，et al.Milk proteins and iron absorption:contrasting effects of different caseinophosphopeptides[J].Pediatr Res,2005,58(4):731-734.
6.Plimmer RH，Lowndes J.Analysis of proteins：the content in amino-acids of the caseinogen and lactalbumin of womans milk[J].Biochem J，1937，31（10）：1751-1757.
7.McSweeney PLH，Fox PF.Chemistry of the Casein.Advanced Dairy Chemistry,New York:Springer Science Business Media,2013.
8.刘微，王振元，张婉舒，等.人乳β-酪蛋白单体二级结构及胶束微观结构的研究[J].中国乳品工业，2014（42）：4-7.
9.刘燕燕，曾新安，陈晓东.FTIR分析脉冲电场和热处理后的大豆分离蛋白结构变化[J].光谱学与光谱分析.2010，30（9）：2340-2344.
播恩集团2024年OEN效能营养欧洲研学
德康农场 | 德康让养猪事业更稳固
如何充分释放热损豆粕的营养价值？
扬翔股份与湘西民族职业技术学院签
第八届国际饲料加工技术研讨会揭幕
脚下有泥，心中有光 | 牧原农艺师
携手共赢，友谊长存：江西正邦作物保
国新办举行7月份国民经济运行情况新
农业农村部就2022年“三夏”生产形势