普境安消毒剂对降低伪狂犬病毒、禽痘病毒活性效果评估

来源：普境安 2019-08-13 10:53:48| 查看：次

委托单位：绿臣(上海)国际贸易有限公司

成都杰鑫玛生物科技有限公司

评价产品：普境安干粉消毒剂

四川农业大学动物生物技术中心

Animal Biotechnology Technology Center of Sicau

声明

　　一、对本报告有异议者，请于收到报告之日起 7 日内以书面方式提出，逾期不予受理。

　　二、本报告所出具的结论和数据，仅对实验样品有效。

　　三、本报告涂改、增删或未加盖实验单位印章的复印件均无效。

　　四、报告书上的实验结果和实验单位名称，不得用于广告及商业宣传。

　　普境安说明：“普境安”主要成分为磷酸盐化合物（85%）、钙、铁、硫酸盐（2.6%）、活性氯、Perica 油（0.05%）和铝硅酸盐（10.1%）。其不具有或具有较低的杀菌、杀结核菌、杀真菌和杀病毒的作用。但具有很强地降低病毒滴度，可能还可以降低大量细菌。减少微生物吸附造成的对表面微生物污染的作用，吸附地板上的水和尿素，减少铵排放，稍微的防臭作用使“普境安”适合用作很好的卫生材料。评价目的：评价“普境安”体外降低伪狂犬、禽痘病毒活性效果。

　　评价方法：将 “普境安”消毒剂设置梯度使用剂量（2/1 推荐剂量、推荐剂量、2 倍推荐剂量）在不同温度（4 ℃、16 ℃、37 ℃）、不同时间（5 min、15min、30 min、45 min）、不同环境和伪狂犬病毒（PRV）、禽痘病毒(FPV)分别作用后测病毒 TCID50，抽提核酸后用荧光定量 PCR 方法检测病毒核酸含量，观察“普境安”对伪狂犬毒和禽痘病毒的吸附效果。模拟消毒剂使用的现场环境（土壤、水泥地、粪便）和伪狂犬病毒、禽痘病毒分别混合后再使用“普境安”干粉消毒剂作用，分别设置 3 个变量（剂量、温度、时间）检测不同情况下“普境安”干粉消毒剂吸附病毒降低病毒活性的作用。

　　评价时间： 2019 年 5 月-6 月

　　1、主要试剂及实验动物

　　1.1毒株

　　猪伪狂犬病毒（PRV-XJ）：保存于四川农业大学动物生物技术中心；禽痘病毒毒株：保存于四川农业大学动物生物技术中心。

　　1.2主要试剂

　　胎牛血清、细胞培养液（DMEM 培养液）、胰蛋白酶、PBS 缓冲液、PK-15 细胞，鸡胚成纤维细胞，荧光 PCR 引物，均由实验室提供；“普境安”消毒剂由丹麦（Stormøllen 公司）、成都杰鑫玛生物科技有限公司生产提供。

　　2、消毒剂安全评估结果

　　2.1伪狂犬病毒和禽痘病毒滴度测定

　　2.1.1病毒液制备

　　将 PRV 病毒液和 FPV 病毒液按常规操作分别接种于生长良好的 PK15 细胞和鸡胚成纤维细胞细胞，37℃、5%二氧化碳条件下培养，当病毒发生 70%-80% 感染时，将病毒液反复冻融 2-3 次，收集病毒液离心取上清，分装于 2 ml EP 管中。

　　2.1.2测定伪狂犬病毒和禽痘病毒的 TCID50

　　取上述制备好的病毒悬液用无血清的 DMEM 细胞培养液进行 10 系列的稀释（10-1～10-10），分别接种于长满单层 PK-15 细胞和鸡胚成纤维细胞细胞的 96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排共 8 孔，每孔接种 100 µL 的病毒悬液；用含 2% PBS 的 DMEM 细胞培养液作为对照，置 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，观察细胞有无 CPE 变化并记录结果。按 Reed-Muench 法计算病毒的 TCID50。

　　2.1.3伪狂犬病毒和禽痘病毒滴度测定结果

　　病毒灭活滴度用半数细胞感染剂量（TCID50）表示。计算公式如下：

　　TCID50 对数值=病变率高于 50%组稀释度的对数值+距离比例（“病变率高于 50%组”是指病变率超过 50%的最低组，下面均简称“高于 50% 组”；“病变率低于 50%组”是指病变率低于 50%的最高组，下面均简称“低于 50%组”）。

　　根据表和表 2 中结果，按 Reed-Muend 法计算出伪狂犬病毒的 TCID50 值为10-8.21/0.1 ml ,禽痘病毒的 TCID50 值为 10-6.73/0.025 ml。

　　2.2普境安消毒剂接触时间对禽痘病毒和伪狂犬病毒体外杀灭效果测试

　　取288个无菌培养皿，一半培养皿（108 个试验组+36 个对照组）涂 1 ml 禽痘病毒液，另一半培养皿（108 个试验组+36 个对照组）涂 1 ml 伪狂犬病毒液后放于 37 ℃无菌恒温箱干燥。向已干燥的病毒培养皿中以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2 剂量加入粉剂“普境安”，在 4 ℃、16 ℃、37 ℃条件下使消毒剂单独与等份的病毒保持接触 5 min，15 min，30 min，45 min（试验组每组设置三组重复，最后取平均值，不同温度下不同时间设置空白对照组无消毒剂作用也做三组重复）。后将“普境安”干粉移除，用 1ml DMEM 细胞培养液重悬收集培养皿中的病毒，做梯度稀释后测定试验组与对照组的 TCID50 对比病毒滴度的差异。

　　试验结果表明（表 3），普境安粉状消毒剂受温度的影响较小，在不同的浓度和环境温度下对病毒均有很好的杀灭作用，在接触 15 分钟后滴度减少平均达到4以上，在作用 30 分钟后滴度减少平均达到 5 以上，但在推荐剂量时杀灭效果最佳。

　　2.3荧光定量检测普境安对禽痘病毒和伪狂犬病毒体吸附效果

　　取288个无菌培养皿，一半培养皿（108 个试验组+36 个对照组）涂 1 ml 禽痘病毒液，另一半培养皿（108 个试验组+36 个对照组）涂 1 ml 伪狂犬病毒液后放于 37 ℃无菌恒温箱干燥。向已干燥的病毒培养皿中以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2 剂量加入粉剂“普境安”，在 4℃、16℃、37℃条件下使消毒剂单独与等份的病毒保持接触 5 min，15 min，30 min，45 min（试验组每组设置三组重复，最后取平均值，不同温度下不同时间设置空白对照组无消毒剂作用也做三组重复）。后将“普境安”干粉移除，用 1ml DMEM 细胞培养液重新悬浮收集培养皿中的干燥病毒，抽提病毒 DNA，检测 DNA 浓度。梯度稀释的标准品（即病毒原液）及待测样品进行实时定量 PCR ，用标准品制作标准曲线，检测对照组和试验组病毒核酸含量，对比差异。

　　试验结果表明（表 4），普境安粉状消毒剂可在不同温度和浓度下均可有效吸附环境中的病毒，在移除普境安粉末的同时能移除大量病毒，其受温度影响较小，推荐剂量在接触 15min 以上能大幅降低病毒量达到较好的清除效果。

　　2.4普境安消毒剂在土壤环境中对病毒的吸附效果

　　试验设置 A、B 组，每组三个重复，A 为伪狂犬病毒组：5×5×5 cm3 的土壤中加 2 ml PRV 病毒原液；B 为禽痘病毒组：5×5×5 cm3 的土壤中加 2 ml FPV 病毒原液，同样在不同温度不同时间下设置空白对照组无消毒剂作用也做三组重复。每组分别设置 4 ℃、16 ℃、37 ℃三个温度梯度，每个温度下以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2 的量加入粉剂“普境安”，作用 5 min、15 min、30 min、45 min后用生理盐水将土壤溶解，4000 r/min 离心 5min 取上清，然后将上清做梯度稀释检测病毒滴度，对比消毒剂处理前后病毒滴度的差异。

　　试验结果表明（表 5），在土壤环境中，普境安粉状消毒剂在不同温度差异较小，在不同的浓度和环境温度下对病毒均有很好的杀灭作用，在接触 5 分钟后大幅度降低病毒滴度，在接触 15 min 后病毒滴度平均降低 4 以上。

　　2.5普境安消毒剂对粪便环境中病毒的吸附效果

　　试验设置 A、B 组，每组三个重复，A 为伪狂犬病毒组：5x5x5 cm3 粪便加 2 ml PRV 病毒原液；B 为禽痘病毒组：5x5x5 cm3 粪便加 2 ml FPV 病毒原液，同样在不同温度不同时间下设置空白对照组无消毒剂作用也做三组重复。每组分别设置 4 ℃、16 ℃、37 ℃三个温度梯度，每个温度下以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2的量加入粉剂“普境安”，作用 5 min、15 min、30 min、45 min 后用生理盐水将土壤溶解，4000 r/min 离心 5min 取上清，然后将上清做梯度稀释检测病毒滴度，对比消毒剂处理前后病毒滴度的差异。

　　试验结果表明（表 6），在粪便环境中，普境安粉状消毒剂在不同温度差异较小，在不同的浓度和环境温度下对病毒均有很好的杀灭作用，在接触 15min 后病毒滴度平均降低 4 以上。

2.7 普境安消毒剂对水泥地面环境中病毒的吸附效果

　　试验设置 A、B 组，每组三个重复，A 为伪狂犬病毒组：100 cm2 的水泥地面上加 2 ml PRV 病毒原液；B 为禽痘病毒组：：100 cm2 的水泥地面加 2 ml FPV病毒原液，同样在不同温度不同时间下设置空白对照组无消毒剂作用也做三组重复。待病毒液干后，每组分别设置 4 ℃、16 ℃、37 ℃三个温度梯度，每个温度下以 25 g/m2，50 g/m2，100 g/m2 的量加入粉剂“普境安”，作用 5 min、15 min、 30 min、45 min 后移除“普境安”，用生理盐水冲洗地面后将其收集。然后做梯度稀释检测病毒滴度，对比消毒剂处理前后病毒滴度的差异。

　　试验结果表明（表 7），在粪便环境中，普境安粉状消毒剂在不同温度差异较小，在不同的浓度和环境温度下对病毒均有很好的杀灭作用，在接触 15min 后病毒滴度平均降低 4 以上。